殼寡糖經(jīng)腸道吸收效率以及與肝癌細(xì)胞結(jié)合特點(diǎn)和抗腫瘤機(jī)制.pdf

1、背景：甲殼素是昆蟲和甲殼類動物的外殼中所含的一種物質(zhì)，是由乙酰氨基葡萄糖組成的聚糖。甲殼素經(jīng)脫乙?；幚淼玫綒ぞ厶?，再經(jīng)過進(jìn)一步降解，形成殼寡糖。殼寡糖的化學(xué)名為聚氨基葡萄糖胺。據(jù)研究，殼寡糖是目前已知自然界中唯一帶正電荷的堿性多糖，也是唯一的動物性膳食纖維素。由于殼寡糖分子量低，水溶性好，生物活性高，人體吸收好，從而克服了甲殼素不溶于水、不易被人體吸收的技術(shù)難題。所以殼寡糖成為當(dāng)今國內(nèi)外研究、開發(fā)的重點(diǎn)領(lǐng)域。研究表明，殼寡糖具有廣泛的

2、生物學(xué)活性：提高機(jī)體免疫力，抗菌抑菌作用，促進(jìn)鈣及其它礦物質(zhì)的吸收，增殖雙歧桿菌、乳酸菌等人體有益菌群，對降血糖、降血脂、降血壓、保護(hù)肝功能等有輔助治療作用。此外，殼寡糖具有明顯的抗腫瘤作用，其對肝癌、肺癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、白血病、肉瘤等都有顯著抑制效果，然而殼寡糖抗腫瘤機(jī)制十分復(fù)雜，是多方面、多層次的過程。 肝癌，是全球最為常見的惡性腫瘤之一。因其惡性度高、病情進(jìn)展快、治療難度大、生存期短，一般發(fā)病后生存時間僅為6個月，故肝癌

3、有癌中之王之稱。并且肝癌是富含血管的腫瘤，極易發(fā)生轉(zhuǎn)移。目前，臨床上的治療一般以手術(shù)、放療、化療為三大支柱，但由于肝癌起病隱匿，發(fā)展變化快，患者就診時往往已進(jìn)入中晚期，失去了最佳手術(shù)時機(jī)。大多數(shù)化療藥物雖可抑制腫瘤細(xì)胞過度增生，但毒副作用大，對正常組織細(xì)胞也有很強(qiáng)的殺傷作用。故尋找新的抗肝癌藥物迫在眉睫。 本實(shí)驗(yàn)組前期致力于殼寡糖吸收分布狀況的研究，發(fā)現(xiàn)殼寡糖能被小腸吸收入血。為了揭示殼寡糖抑制肝癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡的機(jī)制，本

4、實(shí)驗(yàn)組通過使用熒光物質(zhì)標(biāo)記殼寡糖來研究其對腫瘤細(xì)胞的作用，進(jìn)而探討在腫瘤細(xì)胞表面是否存在與殼寡糖特異性結(jié)合的受體。再通過檢測一些與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白以及與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的細(xì)胞因子進(jìn)一步探尋殼寡糖抗腫瘤機(jī)制。 目的：1、研究殼寡糖在體內(nèi)的吸收狀況以及吸收入血和直接排出的比例。2、通過FITC熒光標(biāo)記殼寡糖來檢測肝癌SMMC-7721細(xì)胞表面是否存在與殼寡糖結(jié)合的受體。3、檢測殼寡糖對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的抑制效果及對血管內(nèi)皮

5、生長因子（VEGF）表達(dá)的影響。4、研究殼寡糖能否促進(jìn)入肝癌SMMC-7721細(xì)胞的凋亡以及對凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2和Caspase-3的影響。 方法： 1、利用異硫氰酸熒光素FITC標(biāo)記殼寡糖，并通過聚丙烯酰胺凝膠層析柱（P2凝膠）將游離的FITC除去，再給禁食后的小鼠用FITC標(biāo)記的殼寡糖灌胃，1小時后取血清和腸溶物，經(jīng)處理后，通過熒光分光光度計(jì)分別檢測血清樣品和腸內(nèi)溶物中熒光的強(qiáng)度，進(jìn)而確定殼寡糖是否被吸收入血，以

6、及入血和直接從腸道排出的比例。 2、將FITC標(biāo)記的殼寡糖單獨(dú)作用于人肝癌SMMC-7721細(xì)胞，并與先用未標(biāo)記的殼寡糖作用于肝癌細(xì)胞再用標(biāo)記的殼寡糖作用細(xì)胞進(jìn)行比較，觀察殼寡糖與肝癌細(xì)胞結(jié)合是否有飽和現(xiàn)象進(jìn)而探索肝癌SMMC-7721細(xì)胞表面是否存在與殼寡糖特異性結(jié)合的受體。 3、利用MTT法檢測不同濃度殼寡糖作用于人肝癌SMMC-7721細(xì)胞不同時間后細(xì)胞增殖活性；應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)和Western-blotting檢

7、測殼寡糖作用肝癌細(xì)胞后VEGF表達(dá)量的變化。 4、鏡下觀察不同濃度殼寡糖作用肝癌細(xì)胞后發(fā)生的形態(tài)學(xué)變化，并利用熒光Hoechst33258染色法檢測細(xì)胞凋亡狀況，通過免疫細(xì)胞化學(xué)方法研究殼寡糖對肝癌細(xì)胞SMMC-7721中Bcl-2和Caspase-3表達(dá)的影響。 結(jié)果： 1、FITC能夠標(biāo)記殼寡糖，并且利用P2聚丙烯酰胺凝膠層析柱可以很好的分離出游離的FITC；用標(biāo)記的殼寡糖給小鼠灌胃，從血清和腸溶物中都檢測到

8、熒光強(qiáng)度，兩者比值為2：1。 2、單獨(dú)使用標(biāo)記的殼寡糖作用肝癌細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察所有細(xì)胞均發(fā)出很強(qiáng)的熒光，而先用未標(biāo)記的殼寡糖作用肝癌細(xì)胞再用標(biāo)記的殼寡糖作用后熒光強(qiáng)度明顯減弱。 3、殼寡糖對SMMC-7721細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，呈劑量依賴關(guān)系，并且殼寡糖能明顯降低SMMC-7721細(xì)胞中VEGF的表達(dá)。 4、殼寡糖能促進(jìn)SMMC-7721細(xì)胞凋亡，并能上調(diào)促凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)和降低抑制凋

9、亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。 結(jié)論： 1、殼寡糖能通過小腸被人體吸收，吸收入血的殼寡糖與直接排出的殼寡糖的比例為2：1。 2、殼寡糖能與肝癌細(xì)胞結(jié)合并呈現(xiàn)出飽和性，此現(xiàn)象說明在肝癌細(xì)胞表面有可能存在殼寡糖的特異性受體。 3、殼寡糖對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖有抑制作用，此作用可能是通過抑制VEGF的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。 4、殼寡糖能促進(jìn)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的凋亡，此作用可能是通過促進(jìn)Casp