HDACi聯(lián)合ATRA重啟宮頸癌細(xì)胞RARβ2表達(dá)及其抗腫瘤機(jī)制研究.pdf

1、宮頸癌最常見的女性生殖道惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率居生殖道惡性腫瘤首位。每年全世界大約有53萬新發(fā)病例，約50％患者死于該疾病，其中的80％來自發(fā)展中國家。早期宮頸癌一般推薦采用手術(shù)治療，對于晚期轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的病例，則失去了手術(shù)機(jī)會(huì)，常規(guī)采用化療和放療。然而，由于耐藥的發(fā)生，患者身體耐受狀況的惡化，放、化療效果十分有限。因此，深入探討宮頸癌發(fā)病機(jī)制，尋找更為安全有效、靶向性強(qiáng)的宮頸癌防治辦法意義重大。
　　靶向抑制組蛋白脫乙酰化酶(h

2、istonedeacetylase，HDAC)是一種目前非常有前景的腫瘤治療手段。組蛋白的乙?；揎検且环N重要的基因表達(dá)調(diào)控模式，由HDAC和組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶（histoneacetyl-transferase，HAT）共同調(diào)節(jié)。研究證實(shí)，脫乙?；饔眠^度，導(dǎo)致一系列腫瘤抑制基因下調(diào)/沉默，在腫瘤的發(fā)生過程起到關(guān)鍵作用;在宮頸癌組織中，HDAC活性異常增高;宮頸脫落細(xì)胞學(xué)發(fā)現(xiàn)組蛋白H3乙?；脚c宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervivalint

3、raepithelialneoplasia，CIN)程度相關(guān)。因此，組蛋白脫乙?；敢种苿?histonedeacetylaseinhibitor,HDACi)是一種潛在的宮頸癌靶向治療藥物。
　　全反式維甲酸(all-transretinoicacid,ATRA)是一種上皮細(xì)胞生長和分化的調(diào)節(jié)劑，可以誘導(dǎo)發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞重新進(jìn)入分化程序，而被用于腫瘤的防治。ATRA與受體(retinoicacidreceptor,RAR)結(jié)合，尤

4、其是RARβ2，才能發(fā)揮抗腫瘤作用。RARβ2作為一種重要的腫瘤抑制基因，由于啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化和/或去乙?；揎椂诎▽m頸癌在內(nèi)很多腫瘤中的表達(dá)被沉默。有研究報(bào)道，HDACi可以上調(diào)多種腫瘤RARβ2的表達(dá)。因此，HDACi聯(lián)合ATRA能否重啟宮頸細(xì)胞RARβ2的表達(dá)，并發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用值得深入研究。
　　本課題將分析臨床宮頸癌組織中組蛋白乙?；脚c腫瘤抑制基因(Tumorsuppressorgenes，TSGs)表達(dá)及相

5、關(guān)病理參數(shù)的關(guān)系;深入探討HDACi(VPA和SAHA)聯(lián)合ATRA對宮頸癌細(xì)胞RARβ2的表達(dá)的影響，從表觀遺傳修飾角度來闡明調(diào)控機(jī)制;通過體外實(shí)驗(yàn)，研究HDACi聯(lián)合ATRA的抗宮頸癌作用，并深入探討分子機(jī)制;建立人宮頸癌移植瘤模型，進(jìn)一步評(píng)價(jià)療效和驗(yàn)證分子機(jī)制。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1、宮頸癌組織中組蛋白乙?；胶蚏ARβ2及其下游基因的表達(dá)顯著降低，甚至缺失:選取高、中、低分化的宮頸鱗癌組織65例，免疫組化

6、檢測AcH3、RARβ2、E-cadherin和β-catenin的表達(dá)并評(píng)分。結(jié)果顯示，隨著宮頸癌組織分化程度的降低，AcH3、RARβ2、E-cadherin和β-catenin的表達(dá)逐漸降低、甚至缺失;組蛋白H3的乙酰化水平與RARβ2、E-cadherin和β-catenin的表達(dá)呈顯著的正相關(guān)性（r=0.560，r=0.731，andr=0.733，P均＜0.01）。表明，宮頸癌的進(jìn)展過程中存在表觀遺傳修飾的異常，后者可能參與

7、調(diào)控腫瘤抑制基因RARβ2、E-cadherin和β-catenin的表達(dá)。
　　2、HDACi聯(lián)合ATRA顯著提高宮頸癌細(xì)胞株AcH3水平，重啟RARβ2表達(dá):HDACi聯(lián)合ATRA處理宮頸癌細(xì)胞株HeLa和SiHa48h后，基因表達(dá)譜芯片和Q-PCR結(jié)果證實(shí)RARβ2表達(dá)重啟，轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，而RARα和RARγ則為組成性表達(dá);WB顯示組蛋白乙酰化水平顯著提高，RARβ2表達(dá)量顯著上升。
　　3、AcH3與RARβ2啟

8、動(dòng)子區(qū)域RARE結(jié)合，啟動(dòng)RARβ2表達(dá):以往研究證實(shí)，組蛋白H3第9位賴氨酸乙?；c基因轉(zhuǎn)錄活化相關(guān)。我們采用H3K9ac抗體進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示HDACi聯(lián)合ATRA通過提高H3K9ac水平，后者再與RARβ2啟動(dòng)子區(qū)RARE結(jié)合，從而重啟RARβ2表達(dá)。
　　4、HDACi聯(lián)合ATRA顯著抑制宮頸癌細(xì)胞增殖
　　1)HDACi聯(lián)合ATRA抑制宮頸癌細(xì)胞增殖能力:MTT實(shí)驗(yàn)顯示，HDACi與ATRA聯(lián)合有效抑制宮頸

9、癌細(xì)胞增殖，細(xì)胞增殖抑制率顯著高于VPA和ATRA單一應(yīng)用（P＜0.01），甚至優(yōu)于1mg/L順鉑對宮頸癌細(xì)胞的抑制作用(P＜0.01);ATRA對pIRES2-RARβ2-EGFP穩(wěn)轉(zhuǎn)宮頸癌細(xì)胞株的抑制作用與聯(lián)合用藥效果無顯著差異(P＞0.05），表明HDACi重啟宮頸癌細(xì)胞RARβ2表達(dá)，提供了與ATRA協(xié)同抗腫瘤作用的分子基礎(chǔ)。藥物處理后，Ki67的表達(dá)明顯減少，細(xì)胞集落形成能力被顯著抑制，聯(lián)合用藥效果優(yōu)于任一藥物單用(P＜0.0

10、1)，再次驗(yàn)證了HDACi和ATRA的協(xié)同/相加抑制宮頸癌細(xì)胞增殖的作用。
　　2)HDACi聯(lián)合ATRA引起宮頸癌細(xì)胞G1期阻滯:HDACi和ATRA處理宮頸癌細(xì)胞株48h后檢測細(xì)胞周期，結(jié)果顯示聯(lián)合用藥使細(xì)胞株發(fā)生G1期阻滯;WB結(jié)果表明，HDACi和ATRA顯著上調(diào)P21CIP1和P53的表達(dá)，而p-Stat3水平顯著降低，CyclinD1水平僅輕微下調(diào)。
　　3)HDACi聯(lián)合ATRA誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞分化:細(xì)胞進(jìn)入分化

11、程序前需脫離細(xì)胞周期，WB和免疫組化結(jié)果證實(shí)，HDACi聯(lián)合ATRA顯著提高上皮細(xì)胞分化標(biāo)志物Filaggrin、Loricrin、和Involucrin的表達(dá);FACS和WB結(jié)果顯示，藥物處理后未引起細(xì)胞凋亡的顯著增加。
　　4)HDACi聯(lián)合ATRA通過E-cadherin/PI3K/Akt通路誘導(dǎo)細(xì)胞分化:WB顯示藥物聯(lián)合處理上調(diào)E-cadherin/β-catenin和p-Akt水平;分別采用LE-135拮抗RARβ2、s

12、iRNA沉默E-cadherin、LY-294002抑制PI3K活性、和siRNA沉默Akt1/2表達(dá)，可以阻斷誘導(dǎo)分化作用。表明，HDACi聯(lián)合ATRA重啟RARβ2表達(dá)，通過E-cadherin-PI3K/Akt通路誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞分化。
　　5、HDACi聯(lián)合ATRA抑制裸鼠皮下移植瘤的生長:分別將5×106HeLa和SiHa細(xì)胞裸鼠背部皮下注射，建立移植瘤模型。治療4周后，聯(lián)合用藥顯著抑制腫瘤生長，腫瘤體積顯著小于VPA組和

13、ATRA組(P＜0.01)，與順鉑治療組無顯著差異(P＞0.05)。與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，WB顯示藥物聯(lián)合處理顯著提高組蛋白乙?；剑貑m頸癌細(xì)胞RARβ2并上調(diào)P21CIP1和P53的表達(dá)，而Stat3磷酸化水平顯著降低。免疫組化顯示，聯(lián)合藥物處理抑制Ki67表達(dá)，增強(qiáng)上皮細(xì)胞終末分化標(biāo)志Filaggrin、Loricrin、和Involucrin的表達(dá)。
　　6、建立人宮頸癌組織裸鼠皮下移植瘤模型，驗(yàn)證HDACi聯(lián)合ATRA

14、對宮頸癌的治療作用
　　1)HDACi聯(lián)合ATRA抑制人宮頸癌組織移植瘤的生長:收集人低分化宮頸鱗癌組織，經(jīng)過裸鼠皮下2次移植建立移植瘤模型。藥物治療4周后，聯(lián)合用藥顯著抑制腫瘤生長（P＜0.01），對照組、VPA組、ATRA組和聯(lián)合用藥組腫瘤平均體積分別316.65±94.58mm3，119.83±7.74mm3，and208.64±76.61mm3，66.84±19.10mm3;腫瘤抑制率（percentageoftumor-

15、growthinhibition，％TGI）分別為59.39％,37.58％，和73.33％。
　　2)HDACi聯(lián)合ATRA誘導(dǎo)移植瘤分化及細(xì)胞凋亡:藥物治療4周后，剝離腫瘤組織，HE染色可見聯(lián)合治療組出現(xiàn)細(xì)胞角化和少量角化珠形成，未見核分裂相，而對照組仍維持來源宮頸癌組織的低分化狀態(tài)，核分裂相多見。免疫組化顯示，HDACi聯(lián)合ATRA抑制Ki67表達(dá)，提高AcH3、RARβ2、及Loricrin、和Involucrin的表達(dá);

16、TUNEL檢測顯示，VPA治療后凋亡細(xì)胞增加，聯(lián)合治療組凋亡細(xì)胞增加最為顯著(P＜0.01)。
　　3)HDACi聯(lián)合ATRA通過表觀遺傳調(diào)控機(jī)制重啟RARβ2而發(fā)揮抗腫瘤作用:藥物治療4周后，免疫組化和WB結(jié)果表明組蛋白H3乙?；斤@著提高;ChIP結(jié)果顯示，H3K9ac可以與RARβ2啟動(dòng)子核心區(qū)域RARE結(jié)合，從而啟動(dòng)RARβ2的表達(dá);與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，Q-PCR和WB結(jié)果顯示重啟RARβ2表達(dá)后，其下游E-cadher

17、in和上皮細(xì)胞分化標(biāo)志物Involucrin和Loricrin的表達(dá)顯著上調(diào);同時(shí)P21CIP1、P53和活化的Caspase3表達(dá)上調(diào)，Stat3磷酸化水平顯著降低，Bcl2的表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)。
　　綜上所述，HDACi單獨(dú)和聯(lián)合ATRA可以通過表觀遺傳途徑重啟宮頸癌細(xì)胞RARβ2的表達(dá)，繼而提供了兩者協(xié)同/相加抗腫瘤作用的分子基礎(chǔ);HDACi聯(lián)合ATRA使宮頸癌細(xì)胞脫離細(xì)胞周期，通過E-cadherin/PI3K/Akt通路誘導(dǎo)細(xì)