寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞的體內抗腫瘤活性及機制研究.pdf

1、[研究目的]
　　 腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor-infiltration lymphocyte，TIL)是一群存在于腫瘤間質內的異質性淋巴細胞群，具有特異、高效的抗腫瘤作用，是過繼免疫治療(adoptivecellular immunotherapy，ACI)的一種主要效應細胞。然而，雖然現有的制備方法能得到大量TIL，但經培養(yǎng)擴增的TIL抗瘤活性較低，臨床療效并不理想。研究表明，常規(guī)方法提取的TIL含有一定數量的調節(jié)性T細胞

2、(regulation T cell，Treg)，對于TIL的抗腫瘤活性具有抑制作用，并且TIL某些亞群分泌的TGF-β、IL-10能刺激Treg擴增而導致TIL抗瘤活性低下，是TIL應用于腫瘤治療陷入困境的一個重要原因。因此，如何獲得大量具有高抗瘤活性的TIL是過繼免疫治療的一個關鍵問題。本課題旨在建立一種寡克隆肝癌TIL培養(yǎng)方法，選擇性擴增Treg含量少、抗瘤活性強的TIL細胞群，通過體外實驗，了解TIL抗瘤活性與各種細胞因子之間的

3、關系，通過小鼠體內實驗，研究寡克隆TIL的抗肝癌作用，從而為寡克隆肝癌TIL的過繼免疫治療提供理論依據及實驗基礎。
　　 [研究內容與方法]
　　 1、H22肝癌荷瘤小鼠模型的建立
　　 收集對數生長期小鼠H22肝癌細胞，調整細胞濃度，取0.2 mL（包含約5×106個肝癌細胞），接種于雄性BALB/C小鼠前肢腋窩皮下，待腫瘤生長至直徑約1.0 cm時，處死小鼠，取腫瘤用于肝癌TIL分離和培養(yǎng)。
　　 2

4、、肝癌TIL分離、培養(yǎng)和鑒定
　　 寡克隆TIL培養(yǎng)法:在新鮮分離腫瘤后，在不同部位取多個大小約2.0 mm3的腫瘤組織塊，取材范圍包括腫瘤中心至腫瘤交界區(qū)域(距腫瘤邊緣內2mm)。將組織塊置于24孔板中，加入特定培養(yǎng)基，5％CO2條件下37℃恒溫培養(yǎng)。
　　 常規(guī)TIL培養(yǎng)法:取新鮮腫瘤組織標本，取材范圍包括腫瘤中心至腫瘤交界區(qū)域(距腫瘤邊緣內2mm)。多種酶消化、鋼網過濾、淋巴細胞分離液進行密度梯度離心，用0.2％臺

5、盼蘭染色計數活細胞，之后進行培養(yǎng)擴增。
　　 3、過繼免疫治療實驗
　　 選取腫瘤直徑1.0 cm左右的BALB/C異位移植瘤小鼠18只，隨機分為對照組、常規(guī)TIL治療組、寡克隆TIL治療組，每組6只。通過尾靜脈注射分別給予PBS液、常規(guī)培養(yǎng)的TIL和寡克隆培養(yǎng)的TIL后，監(jiān)測小鼠生長、腫瘤體積變化。治療30 d后處死，收集外周血和腫瘤組織，測量瘤重，檢測外周血細胞因子TGF-β、IL-10和IFN-γ含量，觀察腫瘤組織

6、病理變化以及腫瘤組織內FoxP3和IL-17表達情況，并對實驗數據進行統(tǒng)計學分析。
　　 4、主要檢測方法
　　 (1)流式細胞術檢測TIL純度
　　 應用流式細胞術(flow cytometry，FCM)檢測TIL中CD8+T細胞比例，鑒定TIL純度。
　　 (2)MTT法分析TIL體外細胞毒性
　　 采用四甲基唑藍(MTT)方法，以TIL為效應細胞，小鼠H22肝癌細胞為靶細胞，效靶比例10∶1

7、，分析TIL對肝癌細胞的殺傷活性。
　　 (3)ELISA法測定外周血細胞因子含量
　　 應用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)方法，檢測外周血細胞因子TGF-β、IL-10和IFN-γ含量。
　　 (4)H&E染色和免疫組化法檢測腫瘤組織內TIL及細胞因子
　　 應用H&E染色和免疫組化法檢測腫瘤組織內淋巴細胞浸潤程度以及FoxP3和IL-17的表達，并對實驗數據進行統(tǒng)計學分析。
　　 [實驗結果]

8、
　　 1、建立H22肝癌荷瘤小鼠模型
　　 BALB/C小鼠皮下注射H22肝癌細胞3～4 d后，可見皮下有腫塊形成，并且隨時間延長而不斷增大，2w時用游標卡尺測量腫瘤直徑約1.0 cm。
　　 2、寡克隆肝癌TIL的分離培養(yǎng)及鑒定
　　 寡克隆培養(yǎng)3～4h后，可見有少量淋巴細胞游走出腫瘤組織塊，24 h后在組織塊周圍可見密集的淋巴細胞群。隨著時間延長細胞數目不斷增加，2 w后數量可達到1.2×106/m

9、L。分別收集寡克隆培養(yǎng)和常規(guī)培養(yǎng)的TIL，用流式細胞術檢測CD8+T細胞的比例，寡克隆TIL培養(yǎng)法獲得的CD8+T細胞數(71.25±9.09)％遠高于常規(guī)TIL培養(yǎng)法(41.89±5.57)％，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 3、TIL對小鼠H22肝癌細胞的體外殺傷活性
　　 MTT法分析TIL體外細胞毒性的結果顯示，在培養(yǎng)2w后，寡克隆TIL和常規(guī)TIL對H22肝癌細胞均有殺傷作用，殺傷率分別是(72.56

10、±6.69)％和(46.24±4.03)％，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 4、TIL對小鼠肝癌移植瘤的抑制作用
　　 治療后30 d，常規(guī)TIL治療組與寡克隆TIL治療組的腫瘤體積分別為(1.172±0.085) cm3和(0.891±0.061) cm3，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);瘤重分別為(1.31±0.22)g和(0.91±0.09)g，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);均低于對照組腫瘤體積(1

11、.714±0.040) cm3和瘤重(2.43±0.17)g，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。寡克隆TIL治療組抑瘤率(62.52±3.76)％明顯高于常規(guī)TIL治療組(46.13±9.21)％，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　 5、TIL治療后外周血細胞因子含量變化
　　 外周血細胞因子含量檢測結果顯示，治療后30d，常規(guī)TIL治療組和寡克隆TIL治療組外周血TGF-β含量分別為(241.44±56.01)

12、pg/mL和(65.73±44.79) pg/mL，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);IL-10含量分別為(166.52±59.20) pg/mL和(36.66±18.63) pg/mL，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);均低于對照組(388.21±18.67)pg/mL和(290.74±65.90) pg/mL，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。常規(guī)TIL治療組和寡克隆TIL治療組外周血IFN-γ含量分別為(538.57±103.

13、43) pg/mL和(876.32±114.52) pg/mL，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);均高于對照組(106.66±12.93) pg/mL，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。
　　 6、TIL治療后瘤內淋巴細胞浸潤及細胞因子表達變化
　　 H&E病理染色結果顯示，TIL治療后30 d，腫瘤組織內淋巴細胞浸潤陽性率及中～強陽性率均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);常規(guī)TIL治療組與寡克隆TIL治

14、療組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.330)。
　　 免疫組化法檢測結果顯示，TIL治療后30d，腫瘤組織內FoxP3和IL-17陽性率及中～強陽性率均低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);常規(guī)TIL治療組腫瘤組織內FoxP3陽性率及中～強陽性率均高于寡克隆TIL治療組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);常規(guī)TIL治療組腫瘤組織內IL-17陽性率及中～強陽性率與寡克隆TIL治療組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.682)