肺癌患者腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞優(yōu)勢(shì)取用TCRVβ基因以及其抗腫瘤功能研究.pdf

1、目的：通過(guò)檢測(cè)肺癌患者胸水與自身外周血以及健康志愿者外周血 T細(xì)胞受體TCR Vβ表達(dá)譜來(lái)分析肺癌特異性的TCR基因優(yōu)勢(shì)取用及克隆增殖情況，并克隆肺癌特異性TCR Vβ基因構(gòu)建重組嵌合型腺病毒pDC315-TCR Vβ。研究肺癌特異性TCR Vβ基因修飾的PBMC對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，為TCR基因修飾T細(xì)胞進(jìn)行過(guò)繼性腫瘤免疫治療研究打下基礎(chǔ)。
　　方法：
　　一、收集肺癌患者胸水并利用流式細(xì)胞術(shù)以及Gexp方法來(lái)檢測(cè)TC

2、R Vβ亞家族的比例變化及克隆增殖情況，分析肺癌特異性的TCR Vβ亞家族。
　　二、提取肺癌患者胸水細(xì)胞總RNA，克隆肺癌患者胸水TILs中呈現(xiàn)寡克隆增殖的的TCR Vβ基因并構(gòu)建腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC315-TCR Vβ。
　　三、通過(guò) Lipofectamine2000脂質(zhì)體將嵌合型腺病毒骨架質(zhì)粒與重組穿梭質(zhì)粒pDC315-TCR Vβ共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，獲得能表達(dá)TCR Vβ基因的重組腺病毒。通過(guò)提取病毒基因組PC

3、R鑒定外源目的基因和利用病毒感染PBMC后通過(guò)流式檢測(cè)目的基因表達(dá)量來(lái)鑒定重組嵌合型腺病毒是否能正確表達(dá)外源基因。大量擴(kuò)增鑒定正確的重組嵌合型腺病毒，通過(guò)層析純化系統(tǒng)將病毒純化并用TCID50法測(cè)定滴度。
　　四、將HLA-A2基因克隆到pcDNA3.1載體中獲得重組質(zhì)粒pcDNA3.1-HLA-A2，利用Lipofectamine2000脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NCI-H1299和A549細(xì)胞，并用敏感的G418濃度對(duì)細(xì)胞進(jìn)行篩選。

4、從而獲得穩(wěn)定表達(dá)HLA-A2的細(xì)胞株。
　　五、用重組 TCRVβ腺病毒感染 PBMC，36小時(shí)后分別作用于肺癌細(xì)胞株NCI-H1299（HLA-A2+）、NCI-H1299（HLA-A2-）、A549（HLA-A2-），肝癌細(xì)胞株huh-7（HLA-A2+），乳腺癌細(xì)胞株 Mcf-7（HLA-A2+）。分別在作用12小時(shí)、24小時(shí)以及36小時(shí)后用MTT法檢測(cè)殺傷效果。
　　結(jié)果：流式檢測(cè)發(fā)現(xiàn)肺癌患者胸水TIL中TCR Vβ

5、8亞家族比例顯著升高，而Gexp檢測(cè)結(jié)果示P2患者高表達(dá)的TCR Vβ8基因呈現(xiàn)寡克隆性增殖。PCR及測(cè)序結(jié)果表明從P2患者胸水中成功克隆獲得TCR Vβ8.1-VJ1.3基因，并正確構(gòu)建重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC315- TCR Vβ8.1-VJ1.3。利用腺病毒包轉(zhuǎn)系統(tǒng)包裝出重組腺病毒，從重組病毒基因組中PCR擴(kuò)增得到基因TCR Vβ8.1-VJ1.3，說(shuō)明目的基因成功整合到病毒基因組中。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)重組病毒感染的PBMC表明目的基

6、因可以有效的表達(dá)?？鼓[瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TCR Vβ8.1-VJ1.3基因轉(zhuǎn)染PBMC的抗腫瘤能力為NCI-H1299(HLA-A2+)>A549(HLA-A2-)>huh-7(HLA-A2+)>NCI-H1299(HLA-A2-)>MCF-7(HLA-A2+)。
　　結(jié)論：肺癌患者TILs中TCR Vβ8的比例明顯升高并呈寡克隆增殖，推測(cè)可能是由于在腫瘤局部的特異性抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生的。從高表達(dá)TCR Vβ8并呈現(xiàn)寡克隆性增殖的肺癌患者胸水中