原發(fā)性肝癌浸潤性T淋巴細(xì)胞空間異質(zhì)性分析原發(fā)性肝癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測與預(yù)后關(guān)系研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 原發(fā)性肝癌浸潤性T淋巴細(xì)胞空間異質(zhì)性分析
　　原發(fā)性肝癌（primary liver cancer，PLC），簡稱肝癌，是指在肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞發(fā)生的惡性腫瘤，是我國常見的惡性腫瘤之一。流行病學(xué)研究顯示，肝癌在全球癌癥殺手中位列第2位，在中國，肝癌發(fā)病率居第4位，而死亡率卻僅次于肺癌及胃癌居第3位。盡管近幾年肝癌早期篩查、診斷和治療技術(shù)不斷提升，但是原發(fā)性肝癌的治療效果仍

2、不盡人意。應(yīng)用腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumour infiltratinglymphocytes，TILs)的免疫療法在一些實體瘤病人中取得持久的療效，最近的研究也表明PD-1抗體Nivolumab治療晚期肝細(xì)胞癌患者具有可控的安全性和持久的客觀緩解，提示我們免疫治療應(yīng)用于原發(fā)性肝癌臨床治療的可能性。由于對肝癌腫瘤微環(huán)境中TILs的空間分布、腫瘤局部特征基因和腫瘤突變負(fù)荷等基本生物學(xué)特征以及他們之間的相互聯(lián)系所知甚少，因此有必要對TILs及

3、其與腫瘤之間的相互作用進行深入解析。
　　目的:通過對原發(fā)性肝癌患者腫瘤內(nèi)不同區(qū)域和相應(yīng)的癌旁組織及外周血進行TCRβ-鏈互補決定區(qū)3（complementarity-determining region，CDR3）組庫測序、mRNA表達譜芯片和全外顯子組測序，揭示肝癌內(nèi)TILs的空間分布，探索腫瘤內(nèi)T細(xì)胞群多樣性與局部分子表型或突變負(fù)荷間的關(guān)系。為肝癌的免疫治療提供理論依據(jù)。
　　材料和方法:我們的研究納入5例病理診斷為肝

4、癌的患者，通過手術(shù)收集腫瘤組織、癌旁組織及外周血樣本，每例腫瘤組織按標(biāo)準(zhǔn)選取5個區(qū)域。組織石蠟切片判斷腫瘤細(xì)胞所占的比例。通過多重PCR捕獲和Illumina HiSeq2500測序平臺對TCRβCDR3區(qū)進行深度測序，同時采用mRNA表達譜芯片及Illumina HiSeq2000測序平臺對相應(yīng)組織的mRNA及外顯子捕獲試劑盒捕獲后的DNA區(qū)段進行表達譜芯片分析和外顯子組測序。同時我們將Patient4腫瘤組織5個區(qū)域RNA提取物進行

5、建庫和TCR組庫復(fù)測，評估抽樣及測序技術(shù)引入的誤差。
　　結(jié)果:5例原發(fā)性肝癌患者的25個腫瘤組織樣本測序所獲得的unique TCRβ reads為2.55×105～9.88×105個，癌旁組織為3.33×105～7.51×105，外周血為4.74×105～1.27×106，提示外周血中擁有比腫瘤組織和癌旁組織更多的T細(xì)胞類型（外周血vs腫瘤，p＜0.001;外周血vs癌旁，p=0.007）。腫瘤組織中頻率最高的前250個TCR

6、β序列（TOP250 ubiquitous序列）的累計頻率顯著高于外周血(p=0.039)，此外，每個患者腫瘤組織與腫瘤組織TCR組庫之間的overlap顯著高于腫瘤組織與正常組織或腫瘤組織與外周血TCR組庫之間的overlap(腫瘤-腫瘤vs腫瘤-癌旁，p＜0.001;腫瘤-腫瘤vs腫瘤-外周血，p＜0.001)。每個腫瘤組織中都能檢測到的TOP250序列在5例患者中所占比例從7.92％-24.07％(中位數(shù)10.93％)，而75.9

7、3-92.08％（中位數(shù)89.07％）的T細(xì)胞克隆為多樣性克隆。相關(guān)分析表明TILs克隆多樣性與腫瘤局部T細(xì)胞免疫評分(T cell infiltration score，TIS)及總免疫細(xì)胞評分(overall immuneinfiltration score, IIS)正相關(guān)(RshannonDI vs TIS=0.852, p＜0.001; RshannonDIvsTIS=0.798,p＜0.001)，同時發(fā)現(xiàn)TILs克隆多樣性和

8、TIS評分較高的腫瘤區(qū)域其PD-1表達和抗原提呈裝置(antigen presenting machinery，APM)也相對其他區(qū)域高(RshannonDI vsPD-1=0.613, p=0.001; RTISvsPD-1=0.641, p=0.001; RshannonDIvsAPM=0.574, p=0.003;RTlSvsPD-1=0.56，p=0.004)。值得注意的是，T細(xì)胞群多樣性與腫瘤組織的非同義體細(xì)胞突變的數(shù)目無顯著

9、相關(guān)(R=-0.288，p=0.163)，腫瘤細(xì)胞突變負(fù)荷與APM也無顯著相關(guān)（R=-0.317，p=0.123）。
　　結(jié)論:(1)肝癌患者腫瘤組織微環(huán)境內(nèi)存在腫瘤相關(guān)的T細(xì)胞。(2)腫瘤組織中TILs的分布具有空間異質(zhì)性。(3)腫瘤組織內(nèi)TILs多樣性和PD-1表達都存在空間異質(zhì)性，提示腫瘤微環(huán)境在免疫治療方案制定中非常關(guān)鍵。(4)提高腫瘤組織的APM是提高免疫治療應(yīng)答的關(guān)鍵。
　　第二部分 原發(fā)性肝癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢

10、測與預(yù)后關(guān)系研究
　　原發(fā)性肝癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一。目前，肝癌的臨床治療手段主要有手術(shù)切除、肝移植、介入治療、射頻消融、放化療、分子靶向及免疫治療，首選治療方式為手術(shù)切除和肝移植。研究發(fā)現(xiàn)，無論采用何種治療方法，改善患者術(shù)后生存的主要瓶頸均為術(shù)后不可避免的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。因此，肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移也成為了制約手術(shù)療效的主要因素。目前臨床上主要通過影像學(xué)檢查、血清標(biāo)志物等手段來對肝癌進行診斷、治療和監(jiān)測，但效果均不理想。自從循

11、環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）概念被提出，CTCs逐步進入更多研究者的視野。由于CTCs是原發(fā)灶腫瘤的一部分，具有與原發(fā)灶腫瘤相似甚至相同的特性，因而部分學(xué)者認(rèn)為，CTCs可以作為一種代表原發(fā)灶腫瘤的“液態(tài)活檢標(biāo)本”或“標(biāo)記物”。隨著對CTCs在不同腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移進程中的作用進行系統(tǒng)而深入的研究，人們發(fā)現(xiàn)若能采取有效的方式對腫瘤患者進行外周血CTCs檢測，不僅有助于腫瘤的早期診斷及治療監(jiān)測，還可以有

12、效的對預(yù)后進行預(yù)測。
　　目的:分析肝癌患者病程中CTCs數(shù)量的變化及其與患者AFP水平、TNM分期及早期復(fù)發(fā)（6個月內(nèi)）等臨床病理的關(guān)系，以進一步探討CTCs檢測在原發(fā)性肝癌臨床診治中的應(yīng)用價值。
　　方法:我們首先使用成像流式技術(shù)評估本實驗室前期建立的oHSVI-hTERT-GFP檢測方法是否能特異性捕獲外周血中的肝癌細(xì)胞，隨后選取2015年9月至2016年10月間在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院腹部外科收集的60

13、例原發(fā)性肝癌患者為研究對象。所有受檢者分別在手術(shù)前、術(shù)后第7天及術(shù)后3個月采集外周血4ml;使用oHSVI-hTERT-GFP法檢測患者外周血中的CTCs，分別分析術(shù)前、術(shù)后7天及術(shù)后3個月CTCs數(shù)量與患者AFP水平、肝硬化、乙肝表面抗原、腫瘤數(shù)目、腫瘤大小、TMN分期、分化程度、有無血管癌栓及有無復(fù)發(fā)（6個月內(nèi)）等臨床病理的關(guān)系;并對病程中不同臨床病理特征患者的CTCs數(shù)量變化進行分析，以進一步探討CTCs檢測在原發(fā)性肝癌臨床診治中

14、的應(yīng)用價值。
　　結(jié)果:成像流式細(xì)胞儀成功檢測到肝癌患者術(shù)前外周血中CD45-/GFP+/GPC3+細(xì)胞。納入的60例原發(fā)性肝癌患者全部參與術(shù)前CTCs檢測，分別有42例和35例患者參與術(shù)后7天和術(shù)后3個月的CTCs檢測，其中有34例患者同時接受了3個不同時間點CTCs的檢測。術(shù)前、術(shù)后7天和術(shù)后3個月CTCs檢測陽性率分別為100％、100％和91.43％(32/35)。60例肝癌患者手術(shù)前外周血中CTCs數(shù)量與腫瘤數(shù)目及微血管

15、栓塞顯著相關(guān)，而手術(shù)后7天和手術(shù)后3個月外周血中的CTCs數(shù)量與各臨床病理參數(shù)之間無顯著相關(guān)。手術(shù)后第7天CTCs數(shù)量顯著高于手術(shù)前，而手術(shù)后3個月CTCs數(shù)量則顯著低于手術(shù)后第7天的CTCs數(shù)量，但是與手術(shù)前無顯著差異。不同的TNM分期，CTCs數(shù)量隨時間的變化模式也不盡相同，隨著病程的推移Ⅲ+Ⅳ期患者外周血CTCs數(shù)量呈逐漸升高的趨勢。
　　結(jié)論:(1)手術(shù)前外周血中CTCs數(shù)量與原發(fā)性肝癌患者腫瘤數(shù)目及微血管栓塞顯著相關(guān)。(