鈉鉀泵和鈉氫交換體對(duì)心衰小鼠心肌細(xì)胞收縮力和鈣瞬變的影響.pdf

1、心力衰竭是一種復(fù)雜的臨床癥狀群,是高血壓、缺血性心肌病、心瓣膜病等眾多心臟病的終末階段,其發(fā)病率高、預(yù)后差,是世界性日趨嚴(yán)重的危害健康的主要問(wèn)題。
　　 強(qiáng)心苷(Cardiotonie steroid,Cs)用于治療慢性充血性心力衰竭(Congestive heart failure,CHF)已有200多年歷史,但其加強(qiáng)心肌收縮力的作用機(jī)制卻一直是人們爭(zhēng)論的焦點(diǎn)。一般認(rèn)為:Cs治療心衰是因?yàn)槠湟种扑ソ咝募〖?xì)胞膜上的Na+,K+-

2、ATP酶(NKA),使細(xì)胞內(nèi)Na+增加,通過(guò)Na+/Ca2+交換,引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+的升高,并促進(jìn)肌漿網(wǎng)對(duì)鈣的攝取及隨后的鈣釋放,使心肌收縮力隨之增加。
　　 鈉氫交換體(Na+/H+ exchanger,NHE)作為細(xì)胞膜上的一種交換糖蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體,其功能主要是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH值、細(xì)胞容積以及對(duì)多種不同激素和絲裂原作出應(yīng)答。細(xì)胞內(nèi)酸化變構(gòu)激活NHE,以1:1的比例將胞外的鈉離子與胞內(nèi)的氫離子進(jìn)行交換。NHE的活化導(dǎo)致Na+內(nèi)流,依

3、次活化多種亞型PKC,最終改變基因表達(dá)和蛋白合成,促進(jìn)肥厚的發(fā)生。最近Baartscheer報(bào)道,誘導(dǎo)壓力/容積超負(fù)荷而引發(fā)家兔心肌肥厚并具有心衰體征一個(gè)月后,連續(xù)飼服NHE-1抑制劑兩個(gè)月,可復(fù)原已形成的心肌肥厚、心力衰竭和離子、電生理改變。
　　 Saini HK等報(bào)道,NHE在哇巴因誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca2+]I)的增加中發(fā)揮著重要作用。然而,NHE抑制劑甲基-N-異丁基氨氯吡咪(MIA)在哇巴因存在情況下,

4、對(duì)離體缺血再灌注心臟的正性肌力作用與其對(duì)靜息或KC1去極化的心肌細(xì)胞的[Ca2+]I作用不一致,因此很難解釋NKA與NHE之間的相互作用及兩者在病理情況下發(fā)揮作用的機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)選用小鼠為研究對(duì)象,建立小鼠CHF模型,進(jìn)一步觀察在哇巴因存在或不存在情況下NHE抑制劑對(duì)小鼠正常(NC)和心衰心肌細(xì)胞(CHFC)的肌力作用和[Ca2+]I的影響,以探討抑制NHE作為治療心衰新方案的可能性。
　　 目的:通過(guò)建立小鼠慢性充血性心力衰竭動(dòng)

5、物模型,同步檢測(cè)MIA在哇巴因(ouabian)存在下對(duì)慢性心衰所致小鼠心肌細(xì)胞收縮及鈣瞬變的影響,檢測(cè)CHF小鼠心肌細(xì)胞膜NKAα1、α2亞基和NHE-1蛋白表達(dá)的改變,以探討NKA和NHE-1影響慢性心衰小鼠心肌細(xì)胞肌力作用的機(jī)制。
　　 方法:采用主動(dòng)脈弓縮窄法建立小鼠CHF模型;以酶解法急性分離其左室心肌細(xì)胞,然后采用可視化單細(xì)胞動(dòng)緣探測(cè)系統(tǒng)(Video-basedmotion edge-detection system

6、)同步檢測(cè)不同濃度OUA對(duì)單個(gè)小鼠心肌細(xì)胞舒張、收縮功能及鈣瞬變的變化,并比較同一濃度OUA對(duì)正常和心衰小鼠的心肌細(xì)胞的變化。同步檢測(cè)在OUA存在下,MIA對(duì)單個(gè)小鼠正常和衰竭心臟心肌細(xì)胞收縮力和鈣瞬變的影響,并與單獨(dú)使用MIA的作用進(jìn)行比較。采用Western Blot方法檢測(cè)小鼠NKAα1、α2亞基和NHE-1蛋白表達(dá)的改變。
　　 結(jié)果:(1)OUA對(duì)小鼠NC和CHFC收縮力和細(xì)胞內(nèi)鈣的作用。若將給藥前細(xì)胞收縮幅度、鈣瞬變

7、幅度及胞漿基礎(chǔ)鈣離子濃度標(biāo)準(zhǔn)化為100％,則0.5μM,1μM,5μM,10μM,50μM,100μM,500μM,1mM的OUA使小鼠NC收縮幅度明顯分別增大至(124.60±5.02)％、(133.02±5.65)％、(148.42±6.63)％、(174.14±6.29)％、(204.64±3.66)％、(228.50±10.87)％、(286.42±27.57)％和(288.80±23.82)％(p＜0.01)。為探討OUA對(duì)心

8、肌細(xì)胞正性變力作用與Ca2+的關(guān)系,本研究同步檢測(cè)了OUA對(duì)鈣瞬變的影響。上述濃度的OUA可以使小鼠NC鈣瞬變幅度分別增加為(119.26±4.30)％、(125.43±5.64)％、(126.10±6.77)％、(133.92±10.26)％、(139.72±6.43)％、(152.90±8.10)％、(157.38±11.53)％和(156.39±12.24)％(p＜0.01);5μM,10μM,50μM,100μM,500μM,1

9、mM可以使小鼠NC胞漿基礎(chǔ)鈣離子濃度分別增加為(107.33±2.18)％、(110.82±2.32)％、(111.10±2.81)％、(112.24±2.56)％、(115.72±4.63)％和(116.70±3.80)％(p＜0.01),但0.5μM,1μM OUA對(duì)NC胞漿基礎(chǔ)鈣離子濃度沒(méi)有明顯影響,分別為(103.64±2.26)％和(102.47±3.29)％(p＞0.05);其中0.1μM OUA對(duì)細(xì)胞收縮幅度、鈣瞬變幅度以

10、及胞漿基礎(chǔ)鈣離子濃度均沒(méi)有影響,分別為(104.59±2.35)％、(101.41±1.82)％和(99.62±2.23)％(p＞0.05),而500μM和1mM的OUA使NC很快出現(xiàn)毒性反應(yīng),表現(xiàn)為不規(guī)律收縮,細(xì)胞長(zhǎng)度變短,甚至變?yōu)榍蛐?。?0μM的OUA使小鼠CHFC收縮幅度、鈣瞬變幅度以及胞漿基礎(chǔ)鈣離子濃度分別明顯增大至(351.71±90.6)％、(164.77±6.87)％和(117.67±7.70)％(p＜0.01),較50

11、μM OUA增加NC收縮幅度、鈣瞬變幅度以及胞漿基礎(chǔ)鈣離子濃度的作用顯著為強(qiáng)(p＜0.01)。
　　 (2)MIA對(duì)小鼠NC和CHFC收縮力和細(xì)胞內(nèi)鈣的作用。灌流0.1和1μM的MIA5min后,小鼠NC收縮幅度分別降低至(78.82±5.44)％和(46.93±7.36)％(p＜0.01);鈣瞬變幅度分別降低至(73.41±8.73)％和(49.59±4.01)％(p＜0.01);但對(duì)胞漿基礎(chǔ)鈣離子濃度沒(méi)有明顯影響(p＞0.0

12、5)。灌流0.1和1μM的MIA15min后,小鼠NC收縮幅度明顯分別增加至(142.91±12.64)％和(204.36±27.22)％(p＜0.01);鈣瞬變幅度分別增加為(117.51±2.68)％和(132.51±4.30)％(p＜0.01);胞漿基礎(chǔ)鈣離子濃度分別增加為(115.22±1.90)％和(126.93±3.97)％(p＜0.01)。當(dāng)正性肌力作用達(dá)到最大后,可使NC很快出現(xiàn)毒性反應(yīng),表現(xiàn)為細(xì)胞長(zhǎng)度縮短,甚至變?yōu)榍蛐?/p>

13、。但是,對(duì)于小鼠CHFC,灌流0.1和1μM的MIA5min后,收縮幅度可分別增加至(117.01±1.11)％和(130.08±3.61)％(p＜0.01);鈣瞬變幅度分別增加為(104.64±2.18)％(p＞0.05)和(113.38±2.61)％(p＜0.01),但均對(duì)CHFC胞漿基礎(chǔ)鈣離子濃度沒(méi)有明顯影響,分別為(101.13±4.90)％和(104.21±2.49)％(p＞0.05)。灌流0.1和1μM的MIA15min后,

14、小鼠CHFC收縮幅度(104.55±3.89)％和(101.83±2.62)％、鈣瞬變幅度(100.11±4.59)％和(97.27±3.72)％及胞漿基礎(chǔ)鈣離子濃度(103.63±6.91)％和(99.01±4.82)％均沒(méi)有顯著變化(p＞0.05)。
　　 結(jié)論:哇巴因能夠濃度依賴性增加小鼠心肌細(xì)胞的基礎(chǔ)鈣離子濃度、鈣瞬變幅度以及收縮力,且對(duì)衰竭心臟心肌細(xì)胞的作用較對(duì)正常心臟心肌細(xì)胞的作用顯著為強(qiáng),其原因可能與心衰后小鼠心肌

15、細(xì)胞NKAα1和、α2亞基蛋白表達(dá)均有所降低有關(guān)。NHE-1抑制劑MIA對(duì)正常小鼠心肌細(xì)胞的收縮力和鈣瞬變先減弱后增強(qiáng),而對(duì)心衰小鼠心肌細(xì)胞則僅有短暫的正性肌力作用。低濃度哇巴因(10 nM)能夠部分抵消MIA對(duì)正常小鼠心肌細(xì)胞的收縮和鈣瞬變作用,但卻顯著增強(qiáng)了MIA對(duì)心衰小鼠心肌細(xì)胞的正性肌力作用和鈣瞬變作用,提示NHE與NKA在調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞收縮過(guò)程中存在密切的功能聯(lián)系,且此調(diào)節(jié)取決于心肌細(xì)胞的機(jī)能狀況,在正常心肌細(xì)胞二者呈協(xié)同作用,