ACE抑制劑對心衰大鼠心肌細胞鈣瞬時變化及其調控蛋白的影響.pdf

1、研究目的:該課題擬通過縮窄雄性Wistar大鼠的腹主動脈,制成壓力負荷增加性心衰模型.然后給予3個月的ACEI(perindopril)進行干預治療,在觀察ACEI對大鼠血流動力學影響的同時,一方面分離心肌細胞,在電刺激起搏的情況下,應用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察心肌細胞的收縮情況和鈣瞬變;另一方面對鈣調控蛋白的轉錄和翻譯水平進行半定量測定.旨在:(1)研究心衰時ACEI的長程干預對單個心肌細胞的收縮特性,及收縮力-頻率關系的影響;(2)

2、觀察心衰時ACEI的干預對單個心肌細胞的鈣瞬變,及鈣瞬變-頻率關系的作用;(3)了解ACEI的干預對心衰心肌的主要鈣調控蛋白NCX1、SERCA2、PLB的轉錄和翻譯水平的影響;(4)探討心肌細胞的收縮特性、鈣瞬變及其調控蛋白的關系及ACEI干預后的影響作用.研究方法:1、大鼠壓力負荷增加性心衰模型的制作通過縮窄雄性Wistar大鼠(8周齡,體重200~250g)的腹主動脈,造成50％以上的狹窄,增加左心室后負荷.并用超聲心動圖動態(tài)監(jiān)測

3、其心功能變化,術后16周末發(fā)現(xiàn)其有明顯的心功能受損,并測定血流動力學參數(shù)進一步確定.2、實驗分組和步驟術后16周末,將心衰大鼠隨機分成心衰治療組(CHF-T,n=16)和心衰對照組(CHF-C,n=16),并將假手術者作為假手術對照組(PS,n=10).然后通過灌胃的方法每天給予心衰治療組培哚普利(3mg/kg,用生理鹽水溶解),而心衰對照組和假手術對照組則用生理鹽水代替.持續(xù)12周后從各組存活的大鼠中隨機選取4只,用于分離心肌細胞,進

4、行單個細胞收縮功能和鈣瞬變的檢測.其余的進行血流動力學測定,并取左心室肌進行鈣調控蛋白的mRNA及蛋白水平的半定量分析.3、成年大鼠心肌細胞的分離及單個心肌細胞收縮功能與鈣瞬變的測定成年大鼠的心肌細胞通過主動脈灌流的方法應用膠原酶Ⅰ進行分離.分離完成后用鈣熒光探針Fluo-3/AM進行負載.然后在不同頻率(0.5、1.0、1.5、2.0Hz)的電刺激起搏下(8ms,35V),用激光掃描共聚焦顯微鏡動態(tài)記錄單個心肌細胞的收縮舒張過程和細胞

5、內的熒光強度(F)變化.并按[Ca<'2+>]=Kd×(F-Fmin)/(Fmax-F)計算細胞內游離鈣離子的濃度(nmol/L),其中Fmax為每次實驗測定完成后加入鈣離子載運體A23187(終濃度為10μM),使熒光指示劑飽和后所測得的胞內最大熒光值,Fmin為加入MnCl2(終濃度為2mmol/L)使熒光淬滅后所測得的心肌細胞的最小熒光值,Kd為一常數(shù),37℃為450 nmol/L.從而可測定出心肌細胞的縮短分數(shù)、鈣瞬變的大小與刺

6、激頻率和實驗分組的關系.4、鈣調控蛋白的轉錄和翻譯水平的半定量分析采用RT-PCR的方法,以β-Actin為內參分別測定NCX<,1>、SERCA<,2>、PLB的mRNA在各組中的轉錄水平.分別應用免疫熒光和Western blot等方法測定各組中NCX<,1>、SERCA<,2>、PLB的蛋白相對表達量.結論1、慢性心力衰竭中,ACEI的長程干預不但可以保護心臟的整體功能,而且對單個心肌細胞的收縮特性也具有保護作用.2、ACEI的長