貴陽腐霉侵染致倦庫蚊幼蟲初步研究及貴陽腐霉EGFP轉(zhuǎn)化株的構(gòu)建.pdf

1、目的:（1）觀察貴陽腐霉侵染蚊幼蟲的物理過程并檢測侵染后免疫相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的變化;（2）構(gòu)建含增強型綠色熒光蛋白（EGFP）的雙元表達(dá)載體,利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法,獲得穩(wěn)定表達(dá)EGFP的貴陽腐霉轉(zhuǎn)化株;（3）探討根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)貴陽腐霉的遺傳轉(zhuǎn)化及其影響因素,并優(yōu)化其轉(zhuǎn)化體系。
　　方法:（1）以二齡致倦庫蚊幼蟲為實驗材料進行生物測定,光學(xué)顯微鏡下觀察侵染過程。以正常致倦庫蚊四齡幼蟲為對照,采用SYBR Green

2、Ⅰ實時熒光定量PCR檢測四齡蚊幼蟲感染貴陽腐霉早期cecropin、PPO、transferrin、defensin、gambicin、serpin表達(dá)水平的變化。（2）采用PCR、酶切、去磷酸化、酶連、轉(zhuǎn)化等多種分子生物學(xué)手段,利用潮霉素抗性基因hph為篩選標(biāo)記,以雙元載體pPK2為基本骨架,將增強型綠色熒光蛋白基因egfp置于絲狀真菌組成型啟動子PgpdA和色氨酸C終止子TtrpC之間,構(gòu)建組成性表達(dá)egfp的載體pPK2-EGFP

3、,以貴陽腐霉菌絲體為受體材料,利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法,轉(zhuǎn)入貴陽腐霉表達(dá),并對轉(zhuǎn)化菌株進行傳代培養(yǎng),觀察轉(zhuǎn)化菌株的遺傳穩(wěn)定性以及對蚊蟲的毒力改變;（3）對根癌農(nóng)桿菌預(yù)培養(yǎng)是否加入乙酰丁香酮（AS）、農(nóng)桿菌與菌絲體共培養(yǎng)的溫度(24、25、26、27、28℃)、共培養(yǎng)時間(24、36、48、72、96 h)、共培養(yǎng)中乙酰丁香酮的濃度(100、200、300、400μmol/L)等因素進行研究,觀察上述條件下根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化貴陽腐霉的效

4、率。
　　結(jié)果:（1）在光學(xué)顯微鏡下,觀察到貴陽腐霉游動孢子附著于蚊幼蟲體壁,并萌發(fā)出芽管,鉆入蚊幼蟲體內(nèi)生長,然后穿出體外導(dǎo)致寄主死亡并產(chǎn)生孢子囊,釋放游動孢子的過程。在貴陽腐霉感染早期的四齡致倦庫蚊幼蟲免疫相關(guān)基因表達(dá)水平較正常組均上調(diào)。其中defensin和gambincin表達(dá)上調(diào)最為顯著，分別上調(diào)了165.880和48.101倍，而transferrin僅上調(diào)了1.971倍;（2）成功構(gòu)建了一含有egfp表達(dá)元件的雙元載

5、體,并轉(zhuǎn)入貴陽腐霉中穩(wěn)定表達(dá),在熒光顯微鏡下觀察到菌絲體有綠色熒光產(chǎn)生;（3）根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化貴陽腐霉的條件：農(nóng)桿菌預(yù)培養(yǎng)中加入200μmol/L AS、農(nóng)桿菌與貴陽腐霉共培養(yǎng)溫度26℃、共培養(yǎng)時間72 h、共培養(yǎng)中AS濃度200μmo1/L。
　　結(jié)論:（1）通過光學(xué)顯微鏡下觀察貴陽腐霉侵染致倦庫蚊幼蟲的過程,證實了游動孢子為貴陽腐霉的侵染單位,可以通過游動孢子萌發(fā)芽管的方式直接侵入蚊幼蟲,較直觀地表現(xiàn)了貴陽腐霉對蚊幼蟲的侵染能力