致倦庫(kù)蚊和騷擾庫(kù)蚊差異表達(dá)的氣味受體(OR)基因的功能研究.pdf

1、致倦庫(kù)蚊（Culex pipiens quinquefasciatus）廣泛分布于全球熱帶及亞熱帶地區(qū)，也是我國(guó)南方地區(qū)最常見的蚊種之一，它不僅是我國(guó)淋巴絲蟲病和流行性乙型腦炎的重要傳播媒介，也是西尼羅熱、西方馬腦炎等烈性蟲媒傳染病在我國(guó)的潛在傳播媒介。致倦庫(kù)蚊兼吸人、哺乳動(dòng)物、鳥等多種宿主的血液，可使原本儲(chǔ)存于動(dòng)物宿主中的病原體傳播至人群，所以，一直以來致倦庫(kù)蚊都被列為重點(diǎn)防治對(duì)象?；瘜W(xué)防治是目前致倦庫(kù)蚊最主要的防治方法，但蚊蟲抗藥性

2、的出現(xiàn)及抗藥性水平的不斷提高，導(dǎo)致防治效果越來越差，同時(shí)還對(duì)環(huán)境造成污染。因此，尋找一種對(duì)環(huán)境友好且安全有效的新型防治方法已迫在眉睫。
　　以往的研究發(fā)現(xiàn)，蚊蟲很多重要的行為都是依賴嗅覺系統(tǒng)完成的，并由遺傳基因所決定。蚊蟲的嗅覺系統(tǒng)包含多種嗅覺蛋白，氣味受體是其中比較重要的一種嗅覺蛋白，氣味受體識(shí)別氣味結(jié)合蛋白(OBPs)攜帶的氣味分子并激活嗅覺神經(jīng)元是嗅覺信號(hào)傳導(dǎo)過程中的關(guān)鍵步驟，也是蚊蟲完成搜尋定位宿主、吸血產(chǎn)卵等行為的分子基

3、礎(chǔ)。如果能夠明確氣味受體的功能，不僅對(duì)于闡明蚊蟲的嗅覺機(jī)理十分重要;同時(shí)，對(duì)于尋找防治蚊蟲的新靶標(biāo)，發(fā)展新的方法來干擾或阻斷蚊蟲尋找宿主吸血的過程，開辟新的蚊蟲治理途徑也具有重要的理論意義與應(yīng)用價(jià)值。
　　蚊蟲在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中，遵循“適者生存”的原則，為了滿足自身生理行為的需求，已形成各具特色的氣味受體蛋白家族，對(duì)氣味物質(zhì)表現(xiàn)出不同的靈敏度和辨識(shí)度，同時(shí)，蚊蟲在不同生長(zhǎng)階段，可調(diào)控ORs基因表達(dá)與否及表達(dá)量的高低，表現(xiàn)出對(duì)氣味物質(zhì)

4、不同的行為反應(yīng)。在基因組工程完成的基礎(chǔ)上，致倦庫(kù)蚊大量的ORs基因被分離識(shí)別，絕大部分ORs基因的功能還處于未知狀態(tài)，短時(shí)間內(nèi)不可能逐一進(jìn)行研究，只能通過篩選縮小范圍，深入研究可能在致倦庫(kù)蚊雌蚊搜尋宿主完成吸血行為中起關(guān)鍵作用的ORs基因，為開發(fā)新型蚊蟲防治方法提供理論依據(jù)。
　　騷擾庫(kù)蚊(Culex pipiens molestus)與致倦庫(kù)蚊同屬尖音庫(kù)蚊復(fù)合組(Culexpipiens Complex)，擁有相似的基因組，形態(tài)

5、特征不容易區(qū)分，但生理行為方面存在明顯的差異，其中最為典型的是騷擾庫(kù)蚊屬自育性蚊蟲，雌蚊第一次產(chǎn)卵不需要吸血也可完成。實(shí)驗(yàn)室株騷擾庫(kù)蚊即使第二個(gè)生殖周環(huán)也不吸血或很少吸血，與致倦庫(kù)蚊相比，ORs基因表達(dá)量一定存在差異。如果ORs基因在致倦庫(kù)蚊頭部高表達(dá)，而在騷擾庫(kù)蚊頭部低表達(dá)或不表達(dá)，那么這些ORs基因很可能參與完成致倦庫(kù)蚊雌蚊搜尋宿主、吸血等行為。
　　本研究希望從致倦庫(kù)蚊和騷擾庫(kù)蚊的吸血習(xí)性差異入手，從致倦庫(kù)蚊較多的氣味受體O

6、Rs中篩選出與雌蚊吸血行為相關(guān)的ORs基因。首先通過高通量測(cè)序和RT-PCR方法篩選兩亞種之間差異分布的ORs基因，并運(yùn)用熒光定量PCR方法進(jìn)一步比較差異分布的ORs基因在致倦庫(kù)蚊和騷擾庫(kù)蚊雌蚊頭部的起始表達(dá)量，借助RNA干擾技術(shù)驗(yàn)證起始表達(dá)量差異較大ORs基因是否在致倦庫(kù)蚊雌蚊吸血行為中起關(guān)鍵作用。
　　結(jié)果如下:
　　(1)根據(jù)致倦庫(kù)蚊132個(gè)ORs基因序列，設(shè)計(jì)192對(duì)引物，利用RT-PCR方法擴(kuò)增ORs基因，經(jīng)測(cè)序比

7、對(duì)發(fā)現(xiàn)成功擴(kuò)增125個(gè)ORs基因，占總數(shù)的95％，未擴(kuò)增ORs基因數(shù)7個(gè)。
　　(2)比較成功擴(kuò)增的125個(gè)ORs基因在致倦庫(kù)蚊和騷擾庫(kù)蚊雌蚊不同組織部位及雄蚊中的分布，結(jié)果顯示101個(gè)ORs基因在致倦庫(kù)蚊和騷擾庫(kù)蚊雌蚊頭、胸、腹、足和雄蚊中均有分布，24個(gè)ORs基因在致倦庫(kù)蚊和騷擾庫(kù)蚊雌蚊頭、胸、腹、足和雄蚊中存在差異分布，其中13個(gè)ORs基因在致倦庫(kù)蚊和騷擾庫(kù)蚊雌蚊頭部差異分布。
　　(3)參考高通量測(cè)序結(jié)果，在致倦庫(kù)蚊

8、和騷擾庫(kù)蚊雌蚊中表達(dá)量差異較大的33個(gè)ORs基因。
　　(4)熒光定量PCR技術(shù)分析比較43個(gè)ORs基因（13個(gè)在致倦庫(kù)蚊和騷擾庫(kù)蚊雌蚊頭部差異分布的ORs基因和33個(gè)高通量測(cè)序篩選出的ORs基因，3個(gè)ORs基因重復(fù)）在致倦庫(kù)蚊和騷擾庫(kù)蚊雌蚊頭部的起始表達(dá)量，其中4個(gè)ORs基因（CquiOR25，CquiOR38，CquiOR41和CquiOR68）在致倦庫(kù)蚊和騷擾庫(kù)蚊雌蚊頭部表達(dá)量無顯著差異;39個(gè)在致倦庫(kù)蚊和騷擾庫(kù)蚊雌蚊頭部表

9、達(dá)量具有顯著差異的ORs基因中，26個(gè)ORs基因在致倦庫(kù)蚊雌蚊頭部的表達(dá)量顯著高于騷擾庫(kù)蚊，其中CquiOR5，CquiOR104，CquiOR117表達(dá)量差異倍數(shù)都大于500倍。
　　(5)通過RNA干擾技術(shù)，驗(yàn)證CquiOR5，CquiOR104和CquiOR117基因是否在致倦庫(kù)蚊雌蚊完成吸血行為中起關(guān)鍵作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)靶標(biāo)基因CquiOR5被干擾后，雌蚊對(duì)宿主吸血反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)雌蚊吸血行為有抑制作用;靶標(biāo)基因CquiOR1