淡色庫蚊對有機(jī)磷和氨基甲酸酯抗性相關(guān)基因的研究.pdf

1、淡色庫蚊(Culexpipienspallens)是我國北方廣泛分布的重要病媒蚊蟲，是城市滅蚊的主要對象之一。由于其主要孳生于污水溝中，長期接觸農(nóng)用、林用和衛(wèi)生用有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑，已漸漸對這兩類殺蟲劑產(chǎn)生了抗性。在環(huán)境受到污染的同時(shí)，蚊蟲抗性的產(chǎn)生也大大加大了對其防治的難度，因此迫切需要對殺蟲劑抗性的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)行深入研究。本項(xiàng)研究主要針對淡色庫蚊敏感株和野外株對有機(jī)磷和氨基甲酸酯抗性相關(guān)基因進(jìn)行研究，試圖了解淡色庫蚊抗性相關(guān)

2、代謝酶基因和靶標(biāo)酶基因與抗性水平之間的關(guān)系，探討抗性相關(guān)基因的變化在淡色庫蚊抗性形成中的作用，從分子水平對抗性相關(guān)基因(羧酸酯酶基因和乙酰膽堿酯酶基因)進(jìn)行研究，為更進(jìn)一步深入地研究淡色庫蚊的抗性機(jī)理打下理論基礎(chǔ)。 本研究的主要結(jié)果如下：1.淡色庫蚊野外株對殺蟲劑抗性水平檢測結(jié)果采用殘殺威、敵敵畏和辛硫磷三種殺蟲劑對實(shí)驗(yàn)室敏感株和北京市郊8個(gè)野外株淡色庫蚊進(jìn)行生物學(xué)檢測。結(jié)果顯示淡色庫蚊野外株對不同殺蟲劑均有不同程度的抗性：對殘

3、殺威抗性指數(shù)從3.13至7.24倍，對敵敵畏抗性指數(shù)從2.84至9.88倍，對辛硫磷抗性指數(shù)從1.15至3.33倍。 2.淡色庫蚊篩選抗性株的抗性機(jī)制使用殘殺威對淡色庫蚊野外株進(jìn)行篩選，篩選8代后抗性指數(shù)由原來的4.79倍上升至12.07倍。對敏感株和篩選抗性株分別進(jìn)行羧酸酯酶和乙酰膽堿酯酶活性測定，結(jié)果顯示羧酸酯酶在對殘殺威的抗性形成中作用較小，而乙酰膽堿酯酶的敏感性降低與篩選抗性株的抗性形成有關(guān)。 3.淡色庫蚊野外株

4、酯酶基因表達(dá)量的分析及與對殺蟲劑抗性的相關(guān)性對淡色庫蚊11個(gè)野外株的Estα2-Estβ2基因進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士學(xué)位論文-2-Estα2基因在mRNA中的拷貝數(shù)相差比較大，而Estβ2基因在mRNA中的拷貝數(shù)相差則要小一些。兩個(gè)基因的拷貝數(shù)之間存在著顯著的正相關(guān)關(guān)系，而表達(dá)量卻有一定的差別，所有10個(gè)淡色庫蚊野外株Estα2與Estβ2基因拷貝數(shù)的比值平均為1：18.7。另外，結(jié)果顯示Estα2基因的拷貝數(shù)與對敵

5、敵畏的抗性之間存在著顯著的正相關(guān)關(guān)系，說明淡色庫蚊體內(nèi)Estα2基因的擴(kuò)增與敵敵畏給予的選擇壓力有關(guān)。 4.淡色庫蚊的ACHE1在昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)將淡色庫蚊的Ace1基因ORF序列導(dǎo)入載體在Sf9細(xì)胞中表達(dá)，SDS-PAGE電泳和酶活性測定均顯示已成功的進(jìn)行了表達(dá)。以碘化硫代乙酰膽堿為底物，檢測重組表達(dá)ACHE1的生物學(xué)活性，結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)和上清中的重組表達(dá)酶均具有生物學(xué)活性，細(xì)胞內(nèi)酶蛋白的活性比上清中高。

6、5.淡色庫蚊Ace1基因的可變剪接及對ACHE1酶活性的影響在淡色庫蚊的Ace1基因上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)可變剪接，實(shí)驗(yàn)室敏感株的兩個(gè)個(gè)體Ace1基因的編碼區(qū)相差了24個(gè)堿基，導(dǎo)致所編碼的成熟蛋白在44～51氨基酸殘基處缺失了8個(gè)氨基酸。經(jīng)過在昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)，證實(shí)這段基因的可變剪接對AChE的活性有一定的影響。 6.淡色庫蚊Ace1基因的突變及其可能的生物學(xué)意義在淡色庫蚊的喇叭溝門野外株中，在Ace1基因ORF上發(fā)現(xiàn)了單堿基

7、突變，導(dǎo)致其編碼的氨基酸由丙氨酸突變成了絲氨酸，該點(diǎn)突變發(fā)生在存在于所有物種AChE的保守序列(FGESAG)上，位于AChE活性位點(diǎn)溝的底部，是氧陰離子洞的組成部分。推測與當(dāng)?shù)氐珟煳脤δ撤N氨基甲酸酯或有機(jī)磷殺蟲劑的抗性有關(guān)。7.突變基因在淡色庫蚊野外株中的頻率及可能的生物學(xué)意義 應(yīng)用PCR-限制性內(nèi)切酶法對喇叭溝門株的Ace1基因進(jìn)行突變點(diǎn)檢測，結(jié)果顯示，在2003年喇叭溝門的蚊蟲株中，突變率為19.23％；而在2004年，