AChE固定化及其對(duì)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)方法研究.pdf

1、有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥是最常見的兩類農(nóng)藥，也是目前為止仍然最廣泛使用的農(nóng)藥，它們是一種神經(jīng)毒物，會(huì)抑制人及動(dòng)物體內(nèi)乙酰膽堿酯酶活性，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂，出現(xiàn)中毒癥狀，以至危及生命。近年來(lái)，農(nóng)藥殘留問題越來(lái)越多的受到人們的關(guān)注。雖然政府明令禁止將有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥中的高毒、劇毒品種用于蔬菜果品的生產(chǎn)，但是不少地方仍在使用這些國(guó)家明確規(guī)定在蔬菜上禁用的高毒劇毒農(nóng)藥，因食用含大量農(nóng)殘的蔬菜所引起的人畜中毒事件時(shí)有發(fā)生，帶來(lái)了嚴(yán)重

2、的食品安全問題。 氣相色譜及高效液相色譜技術(shù)檢測(cè)農(nóng)藥殘留具有很高的準(zhǔn)確性和靈敏性，但是它們需要昂貴的儀器設(shè)備、專門的操作人員以及嚴(yán)格的操作環(huán)境，檢測(cè)周期也比較長(zhǎng)，不適合于市場(chǎng)和田間的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。傳統(tǒng)的快速檢測(cè)方法因?yàn)槊舾猩镌傅谋４鏃l件較為苛刻，檢測(cè)又受提取液顏色的影響，給應(yīng)用上帶來(lái)諸多不便。因此，急需研究一些快速、靈敏、便捷的檢測(cè)方法，將高殘留的農(nóng)產(chǎn)品阻擋在交易市場(chǎng)之外，以杜絕食品安全事故的發(fā)生。 本研究的目的是

3、針對(duì)我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品小規(guī)模、分散式的產(chǎn)銷特點(diǎn)，尋找一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏、可靠、實(shí)用的市場(chǎng)果品蔬菜中常見農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)方法。研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下： (1)對(duì)乙酰膽堿酯酶的測(cè)活方法進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)影響測(cè)活的因素進(jìn)行了研究，改進(jìn)了乙酰膽堿酯酶的測(cè)活體系和有關(guān)參數(shù)，即：AChE酶液50μL(1個(gè)固定化酶片)，底物碘化硫代乙酰膽堿50μL，顯色劑雙二硝基苯甲酸50μL，pH8.0緩沖液2.9mL(固定化酶測(cè)活時(shí)加入3.95mL)，終止劑1％SD

4、S1mL(固定化酶測(cè)活時(shí)不用)。 (2)通過對(duì)5種固定化材料的研究，篩選出固定乙酰膽堿酯酶的合適材料為硝酸纖維素膜，并對(duì)固定化的參數(shù)進(jìn)行了探索和優(yōu)化：載體材料浸泡48h，戊二醛濃度0.005％，牛血清白蛋白濃度0.5％，緩沖液pH值6.0，固定化溫度4℃，固定化時(shí)間12h，最終酶活回收率可達(dá)到31.03％。每批次固定化酶活力變異系數(shù)均小于4.04％，各批次之間標(biāo)準(zhǔn)差為0.028，變異系數(shù)為4.16％。每批次及各批次間固定化酶精密

5、度良好，即該固定化方法重現(xiàn)性較好。 (3)對(duì)硝酸纖維素膜固定化AChE酶的特性進(jìn)行了研究，并與游離酶特性進(jìn)行了比較，結(jié)果表明：固定化乙酰膽堿酯酶對(duì)底物的最適反應(yīng)溫度為45℃比游離酶提高5℃，最適pH為8.5比游離酶提高了0.5個(gè)pH單位。對(duì)農(nóng)藥的靈敏度比游離酶有所提高，保存期限比游離酶大大提高，4℃保存一個(gè)月活力僅損失4.6％，活力保存率為相同條件下游離酶的43倍。 (4)建立了固定化乙酰膽堿酯酶目測(cè)法快速檢測(cè)農(nóng)藥殘留的

6、方法，并自制了顯色片。操作步驟為：固定化酶片浸于提取液中，常溫下抑制10分鐘，取出酶片置于載玻片上，同時(shí)放上對(duì)照酶片，在酶片之上放置顯色片，并滴加底物50μL，放入恒溫培養(yǎng)箱35℃反應(yīng)5分鐘，取出載玻片，置于白色濾紙上觀察結(jié)果。對(duì)29種常見農(nóng)藥的最低檢測(cè)限在0.2～5mg/kg之間。 (5)建立了固定化乙酰膽堿酯酶的比色法，對(duì)水樣中8種農(nóng)藥在0.00156～2mg/kg濃度范圍之間線性關(guān)系良好(r＞0.9584)，對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥和

7、氨基甲酸酯類農(nóng)藥檢測(cè)的靈敏度為0.00625～0.0625mg/kg，遠(yuǎn)低于各農(nóng)藥對(duì)應(yīng)的MRL值。 (6)用固定化乙酰膽堿酯酶進(jìn)行了實(shí)際樣品檢測(cè)，目測(cè)法除對(duì)多菌靈、抗蚜威之外，對(duì)其他農(nóng)藥殘留均呈陽(yáng)性；比色法回收率均高于85％，變異系數(shù)在2.96％～5.21％之間，本方法準(zhǔn)確度、精密度均較好，且不受提取液顏色的影響。 (7)兩種檢測(cè)方法與氣相色譜進(jìn)行比較，都擁有較好的符合率(目測(cè)法為75％，比色法為100％)，且其操作簡(jiǎn)單