食管癌高發(fā)區(qū)食管鱗癌與HPV、HLA-G和Lin28b的相關性研究.pdf

1、研究背景：
　　 食管癌是嚴重威脅人類健康的最常見的胸部惡性腫瘤之一。全世界每年新發(fā)食管癌病例大約為40萬，死亡病例約為30萬，大部分食管癌患者發(fā)生在發(fā)展中國家。我國是世界上食管癌發(fā)病率和死亡率最高的國家和地區(qū)之一。20世紀90年代以來，我國食管癌的發(fā)病率、死亡率有所下降，但在河南北部地區(qū)和廣東潮汕地區(qū)，食管癌仍居當?shù)馗鞣N惡性腫瘤死亡原因的第一位;河南新鄉(xiāng)地區(qū)、廣東潮州地區(qū)均屬于我國食管癌高發(fā)地區(qū)。在我國鱗狀細胞癌(squamo

2、uscellcarcinoma)是食管癌最主要的病理組織學類型。對食管癌特別是食管鱗狀上皮細胞癌的研究仍是我國胸外科工作者研究的重點領域。食管鱗狀上皮細胞癌的發(fā)生發(fā)展是長時期多因素（霉菌感染、不良飲食習慣、吸煙、飲酒、微量元素缺乏和環(huán)境污染等）相互作用、多種相關基因或獨立基因（如癌基因、抑癌基因、凋亡抑制因子等）分子改變參與，其先后或同時發(fā)生的積累和疊加作用并最終作用于細胞的生長周期，導致細胞周期調控機制的紊亂、細胞增殖失控、基因受損突

3、變導致正常上皮經(jīng)過各級癌前病變而最終發(fā)展為浸潤性癌腫。雖然根據(jù)目前對腫瘤的發(fā)病機制的認識，應用研究出的靶向藥物治療惡性腫瘤取得了一些進展，但是目前腫瘤癌變多階段演進過程中重要關鍵性的DNA基因突變及某些分子事件及其相互關系還不十分清楚，尋找、確定腫瘤演進過程中共同的起關鍵作用的基因、蛋白和環(huán)節(jié)并將其應用于腫瘤的預防、早期診斷和治療，最終征服腫瘤，還需要進行大量艱苦的工作。
　　 由于惡性腫瘤的發(fā)病機制目前仍未能徹底搞清，所以腫瘤

4、預防和治療的效果仍很不理想，仍需廣大醫(yī)學工作者繼續(xù)不斷探索、研究腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和有效治療。近來，除環(huán)境、飲食和遺傳等因素外，高?；騺喰腿巳轭^狀瘤病毒(HPV)感染與腫瘤的關系越來越受到關注。人乳頭狀瘤病毒屬乳多空病毒科A亞群的一種雙鏈環(huán)狀DNA病毒，為無包膜的20面體對稱病毒，直徑約45-55nm?，F(xiàn)多根據(jù)不同基因亞型HPV與惡性腫瘤發(fā)生的危險性高低分為低危險型和高危險型HPV。正常細胞DNA由于受到HPV的基因組的整合可能會導致癌

5、基因激活，如Ras等使細胞永生化，經(jīng)長期傳代后激活癌基因。E6和E7癌基因是HPV的主要癌基因。當HPV病毒整合進入宿主細胞的基因組中，既可以逃避宿主免疫系統(tǒng)的免疫監(jiān)視和免疫殺傷，而且整合的E6、E7癌基因與相鄰的基因組共同轉錄，可以使轉錄更加穩(wěn)定;體外研究證實高危型HPV編碼產生的E6、E7癌蛋白能有效導致人體細胞發(fā)生惡性轉化，抑制機體的免疫系統(tǒng)。尤其是高危型HPV16、18基因亞型產生的癌蛋白可抑制p53和Rb等，使其喪失抑制細胞生

6、長的效應，激活端粒酶致，使HPV感染的細胞不斷分裂生長，處于異常增殖狀態(tài)，從而使細胞避免凋亡而永生化，進而發(fā)生惡性轉化。HPV感染機體細胞在體內持續(xù)存在，需要逃避機體免疫系統(tǒng)的攻擊，才能發(fā)揮重要的致瘤致癌作用。人類白細胞抗原G(HLA-G)屬于非經(jīng)典的HLA-Ⅰb類分子，是一種重要的免疫耐受分子。HLA-G在正常體細胞中不表達，主要在人類正常妊娠母胎界面的絨毛外滋養(yǎng)細胞表達，通過抑制NK細胞和T淋巴細胞等，來保護胚胎免受母體免疫系統(tǒng)的攻

7、擊。目前的研究發(fā)現(xiàn)HLA-G在乳腺癌、結腸癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤中呈高表達，表明HLA-G可能在腫瘤的免疫逃逸機制中發(fā)揮著重要的作用。Lin28是AmbrosV等在秀麗隱桿線蟲中首先發(fā)現(xiàn)的，其具有調節(jié)線蟲發(fā)育的時序性作用的RNA結合蛋白;Lin28通過抑制Let-7在轉錄后水平發(fā)揮調控作用，進而作用于細胞周期，控制細胞的增殖、分裂和分化;是調節(jié)胚胎發(fā)育的一個重要因子。Lin28在鼠和人胚胎干細胞中呈高表達，并且隨著干細胞誘導不斷分化其

8、表達逐漸降低;在腫瘤組織中則反常高表達。Lin28b是Lin28的同源異構體，主要在干細胞和某些腫瘤細胞中表達。目前對于HPV感染在食管癌變過程中怎樣發(fā)揮作用，HLA-G、Lin28b在食管癌發(fā)生中是否起作用尚不清楚。HPV與HLA-G、Lin28b在食管癌變過程中的相互關系等尚不可知;本研究擬探討HLA-G、Lin28b和HPV在食管鱗癌組織中的表達和相互關系。
　　 本文分兩章，分別闡釋如下:
　　 第一章新鄉(xiāng)地區(qū)食

9、管鱗癌與HPV、HLA-G和Lin28b的相關性研究
　　 1.目的:
　　 研究人乳頭狀瘤病毒（HPV）在新鄉(xiāng)地區(qū)食管鱗狀細胞癌組織、癌旁正常食管組織中的感染情況;
　　 研究HLA-G在新鄉(xiāng)地區(qū)食管鱗狀細胞癌組織、癌旁正常食管組織中陽性表達的情況;
　　 研究RNA結合蛋白Lin28b在新鄉(xiāng)地區(qū)食管鱗狀細胞癌、癌旁正常食管組織中陽性表達的情況;
　　 研究新鄉(xiāng)地區(qū)食管鱗狀細胞癌病人的年齡、性別

10、、腫瘤分化程度、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移與鱗癌組織中感染HPV、HLA-G陽性表達和Lin28b陽性表達之間的關系;
　　 研究新鄉(xiāng)地區(qū)食管鱗狀細胞癌組織感染HPV與HLA-G表達、Lin28b表達之間的關系。
　　 2.方法:
　　 采用基因導流芯片技術，應用潮州凱普生化公司HPV基因分型檢測試劑盒（包括13種高危亞型HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68，5種低危亞

11、型HPV6、11、42、43和44和3種中國人群常見亞型HPV53、66和CP8304），檢測114例食管鱗狀細胞癌組織及50例癌旁正常食管組織中HPV基因亞型感染的情況，
　　 采用免疫組織化學非生物素二步法檢測，用鼠抗人HLA-G單克隆抗體(1:150)和兔抗人Lin28b單克隆抗體(1:100)對114例食管鱗狀細胞癌手術切除石蠟標本、50例癌旁正常食管上皮的石蠟標本組織切片進行染色、觀察，評定HLA-G和Lin28b陽性

12、表達的情況。
　　 應用統(tǒng)計學軟件SPSS13.0進行統(tǒng)計分析。HPV感染、HLA-G、Lin28b在食管鱗癌和正常食管組織中表達的比較、與食管鱗癌組織臨床病理參數(shù)之間的關系采用x2檢驗或Fisher's精確概率法。HPV感染與HLA-G、Lin28b兩指標間的關系采用四格表x2檢驗、Spearman秩相關。HPV亞型感染與HLA-G、Lin28b兩指標間的關系采用列聯(lián)表x2檢驗法。顯著性檢驗水準為α=0.05（雙側），以P＜0

13、.05為差別有統(tǒng)計學意義。
　　 3.結果
　　 新鄉(xiāng)地區(qū)114例食管鱗癌組織及50例癌旁正常食管組織中人乳頭狀瘤病毒感染陽性率分別為63.2％和6％(72/114，3/50)，差異均有統(tǒng)計學意義(x2=45.753，P＜0.001);食管鱗癌存在HPV16、18和52三種亞型感染，HPV16感染率最高，HPV52感染率最低，未發(fā)現(xiàn)多重HPV基因亞型感染。HPV感染率隨食管鱗癌細胞分化程度的降低而增高(x2=6.793，

14、P=0.009)，與患者的年齡、性別、腫瘤浸潤的深度和淋巴結轉移與否無相關性(P＞0.05)。
　　 HLA-G陽性表達產物主要位于細胞質。HLA-G在食管鱗癌及食管正常上皮的陽性表達率分別為51.8％(40/114)和0(0/50)，差異有統(tǒng)計學意義(x2=40.418，P＜0.001)。HLA-G蛋白的陽性表達率隨食管鱗癌細胞分化程度的降低而增高，差異有統(tǒng)計學意義（x2=12.131，P＜0.001）。HLA-G陽性表達率與

15、食管癌患者的年齡、性別、腫瘤浸潤深度和淋巴結轉移無相關性(P＞0.05)。
　　 Lin28b的陽性表達產物主要位于細胞質。Lin28b在新鄉(xiāng)地區(qū)114例食管鱗癌組織中的陽性表達率顯著高于癌旁正常食管組織66.7％vs2％(40/114，1/50)，差異有統(tǒng)計學意義(x2=62.121，P＜0.001);Lin28b的陽性表達率隨食管鱗癌細胞分化程度的降低而增高，差異有統(tǒng)計學意義(x2=11.225，P=0.001);Lin28

16、b的陽性表達率隨腫瘤浸潤深度的進展而增高，差異有統(tǒng)計學意義(x2=4.342，P=0.037);Lin28b的陽性表達率隨淋巴結轉移而增高，差異有統(tǒng)計學意義(x2=21.658，P＜0.001)。Lin28b陽性表達率與患者的年齡、性別無相關性(P＞0.05)。
　　 在食管鱗狀細胞癌組織中HPV陽性組中HLA-G陽性率顯著高于HPV陰性組(x2=11.525，P=0.001)。HPV與HLA-G存在一定正相關關系，但不密切(r

17、s=0.318)。
　　 在食管鱗狀細胞癌組織中HPV陽性組中Lin28b陽性表達率顯著高于HPV陰性組(x2=13.741，P＜0.001)。HPV與Lin28b存在一定正相關關系，但不密切(rs=0.347)。
　　 第二章新鄉(xiāng)和潮州地區(qū)食管鱗癌與人乳頭狀瘤病毒基因亞型感染的相關性研究
　　 1.目的:
　　 研究人乳頭狀瘤病毒(HPV)基因亞型在潮州地區(qū)食管鱗狀細胞癌組織、癌旁正常食管組織中的感染情

18、況;人乳頭狀瘤病毒基因亞型在新鄉(xiāng)和潮州兩地區(qū)食管鱗狀細胞癌組織中的感染情況是否有差異。
　　 2.方法:
　　 采用基因導流芯片技術，應用潮州凱普生化公司HPV基因分型檢測試劑盒（包括13種高危亞型HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68，5種低危亞型HPV6、11、42、43和44以及3種中國人群常見亞型HPV53、66和CP8304）分別對新鄉(xiāng)地區(qū)114例和潮州地區(qū)105例食

19、管鱗癌組織、各50例癌旁正常食管組織（均已經(jīng)福爾馬林固定石蠟包埋處理）進行HPV亞型檢測。
　　 應用統(tǒng)計學軟件SPSS13.0進行統(tǒng)計學分析。HPV感染與食管鱗癌組織、臨床病理參數(shù)之間的關系采用x2檢驗或Fisher's精確概率法。兩個獨立樣本均數(shù)的比較采用t檢驗。顯著性檢驗水準為α=0.05（雙側），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 3.結果:
　　 在新鄉(xiāng)和潮州兩地區(qū)219例食管鱗癌組織中，HPV感

20、染的總陽性率為49.8％;新鄉(xiāng)地區(qū)114例食管鱗癌組織及50例癌旁食管正常組織中HPV感染的陽性率分別為63.2％和6％(72/114，3/50)，差異均有統(tǒng)計學意義(x2=45.753，P＜0.001);潮州地區(qū)食管鱗癌組織中的HPV陽性感染率顯著高于正常食管粘膜組織35.2％vs4％(37/105，2/50)，差異有統(tǒng)計學意義(x2=17.552，P＜0.001)。新鄉(xiāng)地區(qū)食管鱗癌組織HPV的陽性檢出率高于潮州地區(qū)(63.2％vs3

21、5.2％)，差別有統(tǒng)計學意義(x2=17.043，P＜0.001)。在新鄉(xiāng)和潮州地區(qū)食管鱗癌組織中HPV16的陽性率分別為34.2％和23.8％，HPV18的陽性率分別為16.7％和11.4％，HPV52的陽性率分別為12.3％、0。未檢出其它HPV基因亞型感染及多重基因亞型感染。
　　 新鄉(xiāng)地區(qū)HPV感染率隨食管鱗癌細胞分化程度的降低而增高(x2=6.793，P=0.009)，HPV感染率與患者年齡、性別、腫瘤浸潤深度和淋巴結

22、轉移無相關性(P＞0.05);潮州地區(qū)HPV感染率與患者年齡、性別、腫瘤分化、浸潤深度和淋巴結轉移無相關性(P＞0.05)。
　　 結論：
　　 1.新鄉(xiāng)和潮州地區(qū)食管鱗癌組織中都存在人乳頭狀瘤病毒感染;新鄉(xiāng)地區(qū)HPV感染為HPV16、18和52基因亞型，而潮州地區(qū)為HPV16、18基因亞型;不同食管鱗癌高發(fā)區(qū)感染HPV基因亞型可能不同。
　　 2.HLA-G陽性表達產物主要位于食管鱗癌細胞的細胞質;HLA-G蛋

23、白的陽性表達率與食管鱗癌細胞的分化程度有關。
　　 3.Lin28b陽性表達產物主要位于食管鱗癌細胞的細胞質;Lin28b的陽性表達率與食管癌患者腫瘤的分化程度、浸潤深度和淋巴結轉移有關。
　　 4.食管鱗癌感染HPV與Lin28b、HLA-G存在一定正相關關系。
　　 5.HPV、HLA-G與Lin28b可能在食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，但其在食管鱗癌惡變過程中的作用機制仍需進一步研究。
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