基于量子點(diǎn)標(biāo)記抗核抗體檢測(cè)與CCP-AST細(xì)胞的測(cè)定研究.pdf

1、研究背景：
　　量子點(diǎn)(QDs)是近些年發(fā)展起來的一種新型納米材料，直徑在2～20nm，它具備一些傳統(tǒng)染料不可比擬的光電學(xué)優(yōu)勢(shì)，使其可以成為一類理想的生物熒光探針。比如QDs激發(fā)波長(zhǎng)寬、發(fā)射波長(zhǎng)窄，這樣使得可以用同一種波長(zhǎng)的激發(fā)光同時(shí)激發(fā)多種不同量子點(diǎn)而發(fā)射出不同顏色的熒光；QDs的發(fā)射峰窄且對(duì)稱，重疊小，因此在檢測(cè)時(shí)不會(huì)出現(xiàn)互相干擾的問題；QDs具有尺寸效應(yīng)，即通過調(diào)節(jié)QDs的大小和組成，可以產(chǎn)生不同發(fā)射波長(zhǎng)的熒光，據(jù)此特性可以

2、根據(jù)研究需要合成任意粒徑的QDs；最后，QDs的熒光強(qiáng)度和穩(wěn)定性都很好，是普通熒光染料的100倍左右，幾乎沒有褪色現(xiàn)象。QDs在經(jīng)過各種化學(xué)修飾之后，生物相容性也非常好，并且對(duì)生物體危害小。因此將QDs用于生物熒光標(biāo)記，在很多領(lǐng)域如醫(yī)學(xué)診斷、基因和蛋白質(zhì)的高通量分析，特別是在流式細(xì)胞術(shù)免疫分析、快速診斷增敏等方面都具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　研究目的：
　　構(gòu)建基于QDs標(biāo)記實(shí)驗(yàn)診斷與分析技術(shù)平臺(tái)，包括用于抗核抗體(ANA)檢

3、測(cè)的間接免疫熒光法(IIFA)與環(huán)瓜氨酸肽抗原特異性T細(xì)胞(CCP/AST)的流式細(xì)胞術(shù)(FCM)。對(duì)其在ANA臨床樣本檢測(cè)、細(xì)胞成像中的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，同時(shí)研究CCP/AST細(xì)胞在膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(Collagen-induced arthritis，CIA)小鼠疾病發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　研究方法：
　　用2種粒徑不同的QDs制備QDs標(biāo)記二抗[QDs-GAHIgG-F(ab’)2]或QDs標(biāo)記鏈酶親合素(QDs-SA)，

4、分別用單色及多色QDs同時(shí)標(biāo)記，采用間接免疫熒光法(IIFA)對(duì)臨床樣本ANA滴度進(jìn)行檢測(cè)和表征成像，并與FITC標(biāo)記二抗檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。具體包括兩種ANA測(cè)定模式：(1)QDs標(biāo)記IIFA兩步法：用QDs直接標(biāo)記二抗對(duì)溫育標(biāo)本直接進(jìn)行熒光染色；(2)QDs標(biāo)記IIFA-三步法：先行采用生物素化第二抗體與溫育標(biāo)本結(jié)合，再用量子點(diǎn)標(biāo)記QDs-SA進(jìn)行熒光染色。同時(shí)，建立CIA小鼠模型，以QDs-SA結(jié)合生物素化CCP抗原肽，采用FCM檢

5、測(cè)CCP/AST細(xì)胞在CIA小鼠中陽性率，研究其與特異性T細(xì)胞增殖結(jié)果及與炎癥發(fā)生的關(guān)系。
　　研究結(jié)果：
　　1.經(jīng)對(duì)114例自身免疫病患者血清研究發(fā)現(xiàn)，兩種QDs標(biāo)記二抗均可見與FITC標(biāo)記二抗檢測(cè)ANA結(jié)果相同或類似的熒光模式，但ANA滴度略顯不同，對(duì)核顆粒型與胞漿顆粒型ANA測(cè)定靈敏度以QD655為最高，QD605次之，F(xiàn)ITC標(biāo)記二抗相對(duì)較弱。而對(duì)核均質(zhì)型、核仁型與核著絲點(diǎn)型ANA測(cè)定靈敏度高低依次為FITC、QD

6、655和QD605標(biāo)記二抗。相關(guān)分析結(jié)果顯示，兩種QDs與FITC標(biāo)記物檢測(cè)ANA結(jié)果均呈高度正相關(guān)，r值分別為0.834、0.832(P均<0.01)。兩種QDs標(biāo)記二抗對(duì)核顆粒型、胞漿顆粒型熒光模式與FITC標(biāo)記二抗檢測(cè)結(jié)果陽性符合率均為100％；而核均質(zhì)與核仁型檢測(cè)結(jié)果，陽性結(jié)果符合率為80.6％～84.4％；30例用FITC標(biāo)記二抗檢測(cè)ANA陰性血清中，兩種QDs標(biāo)記二抗檢測(cè)均見有1例ANA陽性。兩種QDs與FITC標(biāo)記物檢測(cè)A

7、NA總符合率均超過90.0％，有高度的一致性(Kappa值均>0.75)。
　　2.采用量子點(diǎn)標(biāo)記鏈酶親合素(QD655-SA、QD605-SA、QD565-SA、QD525-SA)與生物素化二抗(Bio-GAHIgG)結(jié)合，對(duì)臨床樣本ANA進(jìn)行檢測(cè)和細(xì)胞成像(IIFA三步法)，可獲得較FITC和QDs標(biāo)記二抗檢測(cè)(IIFA兩步法)更為敏感和準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。除檢出有細(xì)胞核顆粒與細(xì)胞漿顆粒型ANA外，對(duì)細(xì)胞核仁型、核均質(zhì)型與核著絲點(diǎn)

8、型ANA熒光模式亦能敏感檢出。對(duì)臨床樣本和健康人對(duì)照組血清研究發(fā)現(xiàn)，QD655-SA、QD605-SA、QD565-SA與FITC標(biāo)記檢測(cè)陽性結(jié)果符合率均為100％，陰性結(jié)果符合率均為96.7％，具有高度的結(jié)果一致性(Kappa值均>0.75)。與FITC標(biāo)記檢測(cè)ANA結(jié)果滴度呈高度正相關(guān)，r值分別為0.900、0.882和0.938(P值均<0.01)。但QD525-SA檢測(cè)ANA應(yīng)用效果不佳。兩種QDs聯(lián)合應(yīng)用于ANA檢測(cè)，有助于區(qū)

9、分和展示不同細(xì)胞周期核內(nèi)靶抗原分布及可結(jié)合抗原-抗體復(fù)合物量的差異(因摻入熒光比例不同使得整個(gè)細(xì)胞核著染區(qū)分別呈紅色、亮黃色、黃綠色和墨綠色不等)，并可有效實(shí)施ANA檢測(cè)并對(duì)其水平做出合理評(píng)估。
　　3.本實(shí)驗(yàn)在構(gòu)建CIA小鼠模型的基礎(chǔ)上，采用QD705-SA結(jié)合Bio-CCP抗原肽對(duì)CCP特異性T細(xì)胞進(jìn)行體外標(biāo)記和FCM檢測(cè)，結(jié)果以CD4+CD8-CCP/TCR+為CCP/AST細(xì)胞陽性。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CIA模型組小鼠CCP/A

10、ST細(xì)胞陽性率(％)顯著高于對(duì)照組小鼠，分別為0.903±0.960和0.093±0.091，亦顯著高于模型組無關(guān)對(duì)照肽(PD2B)/AST細(xì)胞陽性率(0.149±0.099)，兩者間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。相關(guān)分析結(jié)果顯示，CCP/AST細(xì)胞陽性率與CIA小鼠關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)及用CCP抗原肽、抗CCP抗體、CCP/抗CCP抗體復(fù)合物刺激下淋巴細(xì)胞增殖結(jié)果均呈顯著的正相關(guān)關(guān)系r值分別為0.591、0.728、0.739和0.5

11、81(P<0.01或P<0.05)。提示CCP/AST細(xì)胞的存在與關(guān)節(jié)腫脹和炎癥程度關(guān)系密切。
　　結(jié)論：
　　基于QDs標(biāo)記的IIFA檢測(cè)ANA總體結(jié)果穩(wěn)定、敏感、可信，QDs粒徑越大對(duì)ANA測(cè)定的敏感度越高。采用QDs標(biāo)記鏈酶親合素-生物素系統(tǒng)對(duì)ANA進(jìn)行IIFA檢測(cè)可獲得較FITC與QDs標(biāo)記二抗更為敏感和準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。表征結(jié)果顯示多色量子點(diǎn)標(biāo)記可區(qū)分和展示細(xì)胞核內(nèi)靶抗原定位分布及可結(jié)合抗原-抗體復(fù)合物量的差異，并能