PK-15細(xì)胞與三種益生菌共培養(yǎng)抗TGEV作用及IFn-γ、Il-6mRNA表達(dá).pdf

1、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)可以感染各種年齡和品種的豬，尤其是兩周齡以內(nèi)的仔豬，其死亡率高達(dá)100％，嘔吐、嚴(yán)重腹瀉、脫水為主要的臨床特征，是引起仔豬腹瀉的重要病原體，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失并嚴(yán)重威脅其健康發(fā)展。
　　益生菌具有提高動物生長性能、增強(qiáng)機(jī)體免疫力和治療腹瀉等疾病的作用，因而在畜牧業(yè)受到廣泛地關(guān)注。為了模擬豬腸道內(nèi)環(huán)境，探究細(xì)胞與益生菌間的相互作用對于維持生理穩(wěn)態(tài)以及對細(xì)胞生長繁殖的影響，鑒于PK-15細(xì)胞是TG

2、EV的易感細(xì)胞，所以本實(shí)驗(yàn)利用Transwell小室在體外建立PK-15細(xì)胞與益生菌共培養(yǎng)模型，通過臺盼藍(lán)染色摸索該共培養(yǎng)體系加入益生菌菌體的濃度、PK-15細(xì)胞與益生菌的共培養(yǎng)時間等條件。以共培養(yǎng)體系為平臺，接入TGEV通過MTT比色法檢測其抗TGEV效果，初步研究益生菌-細(xì)胞-病毒三者之間的相互作用關(guān)系。此外，通過實(shí)時熒光定量PCR檢測PK-15細(xì)胞產(chǎn)生的抗病毒細(xì)胞因子IFN-γ和IL-6 mRNA的表達(dá)量，探索細(xì)胞在益生菌作用下的

3、抗病毒效應(yīng)。
　　在體外PK-15細(xì)胞與益生菌共培養(yǎng)模型中，通過臺盼藍(lán)染色檢測不同益生菌菌體濃度和不同共培養(yǎng)時間組合條件下PK-15細(xì)胞的存活率，結(jié)果表明:不同的益生菌菌體濃度、不同的共培養(yǎng)時間，PK-15細(xì)胞的存活率不同。當(dāng)c≤108 CFU/mL且t≤24 h時，PK-15細(xì)胞的存活率較高，達(dá)90％以上;當(dāng)c≤1012 CFU/mL且t≤3h時，PK-15細(xì)胞的存活率可達(dá)80％以上，即在上述兩種情況下，PK-15細(xì)胞與益生菌共

4、培養(yǎng)成立。
　　用MTT比色法檢測不同濃度的益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)3h及濃度均為108 CFU/mL的益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)不同時間，其共培養(yǎng)的抗TGEV效果，結(jié)果表明:在PK-15細(xì)胞與益生菌共培養(yǎng)體系中，當(dāng)益生菌的濃度約為108 CFU/mL及當(dāng)共培養(yǎng)時間延長到12h左右對TGEV的抑制率較高，因此108 CFU/mL為益生菌的最佳濃度，12h為PK-15細(xì)胞與益生菌共培養(yǎng)的最佳時間，并且兩種情況下，對TGEV的抑

5、制程度均為:枯草芽孢桿菌共培養(yǎng)組＞屎腸球菌共培養(yǎng)組＞食淀粉乳桿菌共培養(yǎng)組。
　　濃度為108 CFU/mL的益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)12 h后接種TGEV，檢測不同時間點(diǎn)TGEV滴度，其半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量負(fù)對數(shù)的變化曲線隨時間的增加，呈先上升后下降的趨勢。在PK-15細(xì)胞與枯草芽孢桿菌共培養(yǎng)體系中，當(dāng)收集TGEV時間點(diǎn)為48 h時，其半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量的負(fù)對數(shù)達(dá)到峰值為3.87;在PK-15細(xì)胞與屎腸球菌共培養(yǎng)體系中，當(dāng)收

6、集TGEV時間點(diǎn)為24 h時，其半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量的負(fù)對數(shù)達(dá)到峰值為5.16;在PK-15細(xì)胞與食淀粉乳桿菌共培養(yǎng)體系中，當(dāng)收集TGEV時間點(diǎn)為48 h時，其半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量的負(fù)對數(shù)達(dá)到峰值為4.55。在共培養(yǎng)體系中，每個處理組的TGEV的平均滴度均小于正常病毒組，因此PK-15細(xì)胞與益生菌共培養(yǎng)能降低TGEV的滴度，降低程度為:枯草芽孢桿菌組＞屎腸球菌組＞食淀粉乳桿菌組。
　　將六孔細(xì)胞培養(yǎng)板鋪滿單層的PK-15細(xì)胞進(jìn)行如

7、下分組處理:正常細(xì)胞對照組(Control組)、TGEV感染組（TGEV組）、與濃度為108 CFU/mL枯草芽孢桿菌共培養(yǎng)12h組(BS+Cell組)和與濃度為108 CFU/mL枯草芽孢桿菌共培養(yǎng)12 h后感染TGEV組(BS+Cell+TGEV組）然后分別在1h、3h、6h、12h、24 h收集PK-15細(xì)胞樣品實(shí)時熒光定量PCR檢測不同時間點(diǎn)各組PK-15細(xì)胞中IFN-γ和IL-6 mRNA表達(dá)量的變化，結(jié)果表明:PK-15細(xì)胞

8、與枯草芽孢桿菌共培養(yǎng)后感染TGEV能刺激IFN-γ和IL-6 mRNA表達(dá)量增加，作用效果為先快速增加，后逐漸減小。BS+Cell+TGEV組在3h、6h時均顯著刺激IFN-γ mRNA表達(dá)量增加，在1h、3h時均能顯著刺激IL-6 mRNA表達(dá)量增加，在3h時IFN-γ和IL-6mRNA表達(dá)量達(dá)到最大值。TGEV和枯草芽孢桿菌也都能刺激PK-15細(xì)胞IFN-γ和IL-6 mRNA表達(dá)量增加，并與BS+Cell+TGEV組有相同的趨勢，