基于代謝組學(xué)的白念珠菌對唑類藥物交叉耐藥機(jī)制的研究.pdf

1、白念珠菌引起的侵襲性真菌感染率和死亡率與日俱增，給臨床抗真菌感染治療帶來很大困擾。唑類藥物，尤其是氟康唑，因其安全性高、療效好和副作用小而成為防治真菌感染的一線藥物，但其僅具有抑菌作用，因此在長期治療過程中產(chǎn)生了耐藥性，使其對氟康唑耐藥的同時對其他結(jié)構(gòu)不同、作用靶點(diǎn)不同的抗真菌藥物也產(chǎn)生耐藥性。近年來，耐藥菌的出現(xiàn)使真菌防治治療雪上加霜。因此，研究白念珠菌對唑類藥物的交叉耐藥機(jī)制顯得迫切重要。
　　代謝組學(xué)旨在從整體角度表征機(jī)體的

2、代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其研究特點(diǎn)與白念珠菌復(fù)雜的耐藥機(jī)制不謀而合。在本課題組前期研究基礎(chǔ)上，我將進(jìn)行代謝足跡分析和磷脂代謝組學(xué)分析，從而完善白念珠菌代謝組學(xué)研究平臺，為了驗證該平臺的有效性，我們將其用于白念珠菌對唑類藥物交叉耐藥機(jī)制及紫草素抗被膜型白念珠菌作用機(jī)制研究:
　　針對磷脂的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其特征碎片離子，構(gòu)建親水作用色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(HILIC-QQQ/MS)。在對色譜質(zhì)譜條件和提取方法優(yōu)化的基礎(chǔ)上，將該方法成功應(yīng)用于

3、白念珠菌磷脂代謝組學(xué)研究。結(jié)果表明，磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺是含量較多的兩類磷脂，C16∶0、C16∶1、C17∶1、C18∶0、C18∶1、C18∶2和C18∶3是白念珠菌中的主要脂肪酸。給藥組中PE(32∶2)含量顯著降低，而脂肪酸不飽和指數(shù)顯著升高，表明兩性霉素B可能通過影響細(xì)胞膜流動性和破壞細(xì)胞膜的穩(wěn)定性而發(fā)揮抗真菌作用，從另一角度證明兩性霉素B的作用靶點(diǎn)位于細(xì)胞膜。該方法的建立為后續(xù)的白念珠菌對唑類藥物的交叉耐藥機(jī)制研究奠定基

4、礎(chǔ)。
　　采用UPLC-Q-TOF/MS和GC-MS高通量分析技術(shù)相結(jié)合的代謝組學(xué)方法對白念珠菌細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外代謝物分別進(jìn)行代謝指紋分析和代謝足跡分析，從多層次、多角度、最大限度的獲取樣品中的有效信息的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步細(xì)化差異代謝物產(chǎn)生的原因，通過多元統(tǒng)計學(xué)方法分析得到25個菌株不同生物標(biāo)志物、43個敏感菌藥物應(yīng)激相關(guān)標(biāo)志物、45個耐藥菌藥物應(yīng)激相關(guān)標(biāo)志物和20個菌株耐藥強(qiáng)弱相關(guān)標(biāo)志物，把菌株是否耐藥做為因素A，把給藥與否做為因素B

5、，采用雙因素方差分析發(fā)現(xiàn)其中25個相關(guān)標(biāo)志物是交互作用產(chǎn)生的。這些標(biāo)志物主要涉及氨基酸代謝、三羧酸循環(huán)、應(yīng)激代謝、磷脂代謝和鞘脂代謝。進(jìn)一步采用HILIC-QQQ/MS對白念珠菌耐藥相關(guān)通路進(jìn)行代謝靶標(biāo)分析，挖掘與耐藥密切相關(guān)的磷脂。這些發(fā)現(xiàn)揭示了耐藥菌可能通過增強(qiáng)對外界刺激的抵抗力、降低細(xì)胞內(nèi)活性氧、增強(qiáng)藥物外轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的過表達(dá)、改變細(xì)胞膜流動性、破壞細(xì)胞膜穩(wěn)定性以及影響線粒體功能來降低對抗真菌藥物的敏感性，從而達(dá)到抗真菌藥物作用。

6、r>　　我們以被膜型白念珠菌為研究對象，建立氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)的代謝組學(xué)方法來研究中藥活性單體紫草素抗被膜型白念珠菌的代謝調(diào)控機(jī)制，通過多元統(tǒng)計學(xué)分析篩選到19個紫草素給藥相關(guān)的生物標(biāo)志物，主要涉及氨基酸代謝、三羧酸循環(huán)、糖酵解、能量代謝、脂肪酸代謝和應(yīng)激反應(yīng)，這一結(jié)果表明紫草素可能是通過調(diào)控這些代謝通路發(fā)揮對被膜型白念珠菌的抗真菌作用。
　　本論文首次采用UPLC-Q-TOF/MS、GC-MS和HILIC-QQQ/