膠原樣結構巨噬細胞受體介導的線粒體凋亡在染矽塵大鼠肺纖維化中的作用.pdf

1、目的：1、通過抑制肺泡巨噬細胞（Alveolar macrophage, AM）表面膠原樣結構巨噬細胞受體（Macrophage receptor with collagenous structure, MARCO）及線粒體凋亡通路相關靶點后檢測AM內(nèi)活性氧（Reactive oxygen specises, ROS）及線粒體膜電位變化水平，肺組織MARCO、細胞色素C（Cytochrome C, CytC）、天冬半胱氨酸特異性蛋白-9

2、（Cysteinyl aspartate specific protease-9, Caspase-9）、Caspase-3、B細胞淋巴瘤/白血病-2蛋白（B cell lymphoma/lewkmia-2, Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 assioated X protein, Bax）水平，探討MARCO介導的肺泡巨噬細胞線粒體凋亡通路發(fā)生機制。2、通過檢測肺組織Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA表達水平，觀察肺組織病理變化，

3、分析線粒體凋亡通路在矽肺纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用。3、通過比較矽肺形成前的預防性干預措施與矽肺形成后的治療性干預措施對染矽塵大鼠各指標的不同影響，探討不同時段干預措施的療效。
　　對象與方法：無特定病原體級健康成年雄性SD大鼠176只按體重隨機分為6組：生理鹽水對照組（24只）、矽肺模型組（24只）、N-乙酰半胱氨酸（N-Acetylcysteine, NAC）組（32只）、環(huán)孢霉素A（Cyclosporin A, CsA）組（32

4、只）、Caspase-9抑制劑組（32只）、多聚鳥苷酸（Polyguanylic acid, PolyG）組（32只），各組按照施加干預的時間點不同分為預防組和治療組，預防性及治療性干預均設置后續(xù)觀察組（繼續(xù)觀察28天）。除生理鹽水對照組外，其余各組均進行矽肺造模。各預防組大鼠自造模當天開始給予不同的干預處理，分別于染塵后第28天、第56天處死大鼠各8只；治療組大鼠于造模28天后給予不同的干預處理，分別于染塵后第56天、第84天處死大鼠

5、各8只。收集左側肺泡灌洗液，分離純化AM，流式細胞術檢測線粒體去極化率和ROS陽性率；取左肺組織適量，實時定量熒光聚合酶鏈式反應（Real-time PCR）分析Ⅰ型和Ⅲ型前膠原mRNA表達水平；取適量肺組織勻漿、細胞裂解后，免疫印跡法測定肺組織內(nèi)MARCO、Bcl-2、Bax、CytC、Caspase-9和Caspase-3水平。右側肺組織經(jīng)多聚甲醛固定，常規(guī)制作石蠟切片，蘇木素-伊紅染色觀察肺組織病理變化。
　　結果：1、不同

6、組別大鼠肺組織病理變化。生理鹽水對照組大鼠肺組織結構清楚，肺泡壁薄，但肺間質(zhì)有輕微炎癥；矽肺模型組大鼠肺組織內(nèi)有炎細胞浸潤，以淋巴細胞和巨噬細胞滲出為主，出現(xiàn)了典型的纖維性結節(jié)，結節(jié)由巨噬細胞和成纖維細胞構成，可見程度不同的肺泡壁和小血管壁增厚，以結節(jié)處增厚更為顯著，隨著染塵時間的延長矽結節(jié)數(shù)量增多，部分矽結節(jié)出現(xiàn)了融合；NAC組、CsA組、Caspase-9抑制劑預防組和和PolyG組大鼠肺組織均未見細胞性結節(jié)或矽結節(jié)，Caspase

7、-9抑制劑治療組有散在的細胞性結節(jié)，但各組均有普遍的炎細胞浸潤，隨著觀察時間的延長，炎癥改變均出現(xiàn)了不同程度的緩解，以PolyG組減輕最為顯著，但各組大鼠肺組織均有肺氣腫現(xiàn)象。2、不同組別大鼠AM線粒體凋亡通路相關蛋白含量比較。染塵后第28d、56d和84d生理鹽水對照組間大鼠肺組織MARCO、CytC、Caspase-9、Caspase-3、Bax和Bcl-2水平差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），矽肺模型組大鼠肺組織除Bcl-2含量

8、隨觀察時間延長減少外，其他蛋白水平均隨觀察時間延長增加（P<0.05）。NAC組及CsA組（預防性和治療性）大鼠肺組織MARCO、CytC、Caspase-9、Caspase-3和Bax含量均高于同期生理鹽水對照組，但低于矽肺模型組，Bcl-2含量較矽肺模型組高，生理鹽水對照組低（P<0.05）；染塵后第28d、第56d Caspase-9抑制劑組（預防性及治療性）大鼠肺組織CytC與同期矽肺模型組相比差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）

9、，其他指標均與NAC組趨勢一致；與相應生理鹽水對照組比較，染塵后第28d PolyG預防組大鼠肺組織MARCO及CytC差異無統(tǒng)計學意義，染塵后第56d PolyG預防組MARCO、CytC、Caspase-3和Bax差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），其他指標與NAC組趨勢一致。3、不同組別大鼠AM內(nèi)ROS含量及線粒體膜電位變化水平。染塵后第28d、56d和84d生理鹽水對照組間大鼠AM ROS陽性率和線粒體膜電位去極化率均低于相應矽肺

10、模型組（P<0.05）；NAC組及CsA組（預防性和治療性）大鼠AM ROS陽性率和線粒體膜電位去極化率均高于同期生理鹽水對照組，但低于矽肺模型組（P<0.05）；染塵后第28d Caspase-9抑制劑預防組大鼠AM ROS陽性率與同期矽肺模型組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），其他指標均與NAC組趨勢一致；染塵后第56d PolyG預防組大鼠AM ROS陽性率與同期生理鹽水對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），其他指標均與

11、NAC組趨勢一致。4、不同組別大鼠肺組織細胞Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA表達水平分析。染塵后第28d、56d和84d生理鹽水對照組間大鼠肺組織Ⅰ型前膠原mRNA表達水平逐漸升高（P<0.05），Ⅲ型前膠原mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；矽肺模型組大鼠肺組織Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA表達水平均隨染塵時間延長而增加（P<0.05）；NAC組、CsA組和Caspase-9抑制劑組（預防性和治療性）兩指標均高于同期生理鹽水對照組，低于矽

12、肺模型組（P<0.05）；與相應生理鹽水對照組比較，PolyG預防組大鼠肺組織Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA表達水平均無統(tǒng)計學差異，但均低于矽肺模型組，PolyG治療組兩指標與NAC組趨勢一致。5、不同干預時段對不同組別大鼠AM線粒體凋亡通路相關指標的影響。染塵后第28d各預防組與染塵后第56d各相應治療組比較，生理鹽水對照組大鼠肺組織MARCO、CytC、Caspase-9、Caspase-3、Bax、Bcl-2、Ⅲ型前膠原mRNA表達水平，

13、AM ROS陽性率和線粒體膜電位去極化率差異均無統(tǒng)計學意義（P<0.05），Ⅰ型前膠原mRNA表達水平降低（P<0.05）；矽肺模型組大鼠AM ROS陽性率和線粒體膜電位去極化率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），肺組織Bcl-2水平升高，其他指標均降低（P<0.05）；NAC組、CsA組和PolyG組大鼠上述指標除Bcl-2升高外，其他指標均降低（P<0.05）；Caspase-9抑制劑組大鼠肺組織Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA表達水平、AM線

14、粒體膜電位去極化率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），Bcl-2含量升高，其他指標均降低（P<0.05）。
　　結論：1、抑制MARCO及線粒體通路相關靶點后，肺泡巨噬細胞內(nèi)ROS及線粒體膜電位變化水平，肺組織 MARCO、CytC、Caspase-9、Caspase-3、Bax/Bcl-2水平均出現(xiàn)不同程度的下調(diào)，表明 MARCO結合二氧化硅在肺泡巨噬細胞線粒體凋亡通路啟動中發(fā)揮著重要的作用。2、抑制 MARCO及線粒體通路相關靶