蝙蝠蛾擬青霉菌絲體抗疲勞與耐缺氧作用及其機(jī)制研究.pdf

1、冬蟲夏草為我國一種傳統(tǒng)藥材，自古以來就被作為滋補(bǔ)類中藥而被廣泛運用。改革開放后，隨著我國醫(yī)藥研究的快速發(fā)展，冬蟲夏草及其人工發(fā)酵培育替代品的功能也逐漸被揭示，同時也受到世界范圍內(nèi)的廣泛關(guān)注與研究。目前，國內(nèi)外研究已經(jīng)表明蟲草及其提取物或人工替代品具有多種藥理學(xué)活性，如抗疲勞、耐缺氧、改善免疫功能、抗腫瘤、降血糖等作用[1，2]。然而野生冬蟲夏草種類繁多，已發(fā)現(xiàn)種類多達(dá)400多種[3]，各類蟲草及其替代品性質(zhì)千差萬別，對于普通患者或正常消

2、費者來說更不易鑒別。此外，由于天然蟲草生長條件苛刻，自然資源枯竭，并且市場的需求過多，價格昂貴，天然蟲草已成為瀕危資源，對其保護(hù)與合理利用刻不容緩。因此，目前對于研究開發(fā)藥效穩(wěn)定的蟲草替代物日趨重要，這也是解決上述問題的有效途徑。
　　本課題所研究的藥物蝙蝠蛾擬青霉菌絲體(Paecilomyces hepiali mycelium:PHM)源于西藏野生冬蟲夏草中提取分離的蝙蝠蛾擬青霉菌株，并利用人工發(fā)酵培育的方式，對其進(jìn)行大規(guī)模生

3、產(chǎn)、提純，從而得到的大量蝙蝠蛾擬青霉菌絲體。對其藥效的研究不僅可以評價其作為蟲草替代品的潛力，緩解野生蟲草的市場需求，同時也有利于保護(hù)瀕危的野生冬蟲夏草資源，并為其作為治療藥物的研發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。
　　疲勞是一種較為普遍的生理現(xiàn)象，其包括軀體疲勞及精神的疲勞。疲勞不僅嚴(yán)重影響我們的工作效率，運動能力，同時還影響到我們的家庭生活，甚至社會關(guān)系[4]。疲勞不僅伴隨著各種疾病的發(fā)生如HIV、肝炎及腫瘤等[5，6]，而且也

4、會導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降，內(nèi)分泌失調(diào)，從而引起各種疾病，如感染、糖尿病等[7，8]。本研究主要對PHM的抗疲勞與耐缺氧作用進(jìn)行了評價，并且對其機(jī)制進(jìn)行簡單的探討。
　　研究目的:
　　本課題主要研究人工發(fā)酵培育的蝙蝠蛾擬青霉菌絲體(PHM)抗慢性疲勞（Chronic fatigue: CF）作用、預(yù)防性抗疲勞作用、耐缺氧作用及其潛在的作用機(jī)制，為研發(fā)高效穩(wěn)定的野生冬蟲夏草替代品提供一定的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。
　　研究方法:

5、
　　第一部分實驗:PHM對小鼠慢性疲勞的影響
　　將72只雄性昆明小鼠隨機(jī)分為6組，包括1個正常飼養(yǎng)組（Home）及5個CF組，6組小鼠分別灌胃(i.g)給予溶媒、溶媒、13 mg/kg莫達(dá)非尼、140 mg/kgPHM、280 mg/kg PHM以及560 mg/kg PHM。Home組小鼠不進(jìn)行攀跑訓(xùn)練，CF組小鼠在18天的訓(xùn)練中，每天于給藥后40 min通過小鼠輪式疲勞儀強(qiáng)迫小鼠進(jìn)行攀跑訓(xùn)練30分鐘。第一天的速度設(shè)為

6、10.2 m/min，并分別在第5、9、13、17天將速度逐漸增加至10.8 m/min、11.4 m/min、12 m/min以及12.6 m/min。第19天進(jìn)行力竭訓(xùn)練，速度保持12.6m/min，并將攀跑時間延長至1h。在訓(xùn)練過程中如果小鼠攀跑速度下降或停止攀跑，其將滑落至通道的底端并受到1.2 mA的電流電擊[9]，以此來強(qiáng)迫小鼠完成訓(xùn)練任務(wù)。記錄每次訓(xùn)練過程中每只小鼠受到電擊的次數(shù)，并以此來評價小鼠疲勞程度。小鼠遭受的電擊次

7、數(shù)越多，則說明其軀體疲勞程度越嚴(yán)重。
　　在第19天力竭疲勞訓(xùn)練結(jié)束后，將小鼠置于安靜環(huán)境中休息40min。通過眼眶取全血樣本于2mL塑料離心管中，45度斜面靜置30 min，4000×g離心15min，取上清存于-20℃冰箱備用。頸椎脫斷處死小鼠后立即取新鮮后腿肌肉及肝臟組織樣本，用冰冷生理鹽水沖洗后，再用濾紙吸干，稱重，存于-20℃冰箱備用。應(yīng)用試劑盒檢測小鼠的肌糖原(MG)，肝糖原(LG)，血清尿素氮(SUN)，血清乳酸(S

8、LA)和血清肌酸激酶(CK)水平。
　　第二部分實驗:PHM預(yù)防性抗疲勞作用
　　按照同樣方法將72只雄性昆明小鼠隨機(jī)分為6組。除莫達(dá)非尼組每天給藥一次外，其余各組每天灌胃給予兩次PHM或溶媒，劑量與第一部分實驗相同，連續(xù)給藥14天。在給予14天的藥物后，除Home組外，其他5組于給藥后40 min，8h，24 h，48 h進(jìn)行30 min的攀跑訓(xùn)練，并且在給藥后第72 h進(jìn)行60 min的力竭攀跑訓(xùn)練。攀跑速度設(shè)為12.6

9、 m/min，電流仍為1.2 mA，記錄每次訓(xùn)練過程中每只小鼠受到電擊的次數(shù)。
　　力竭訓(xùn)練結(jié)束后，將小鼠置于安靜環(huán)境中休息40 min。通過眼球摘除取血，血液樣本分為兩份，其中一份加入肝素制備為抗凝全血，存于4℃冰箱，用于檢測血紅蛋白含量(Hb)和全血ATP水平。另一份為未抗凝的全血，按照第一部分實驗的方法處理后用于檢測血清尿素氮(SUN)、血清乳酸(SLA)、血清肌酸激酶(CK)水平。另外，按照第一部分相同方法取小鼠的肝臟和肌

10、肉組織，檢測小鼠的肝糖元(LG)、肌糖元(MG)水平。
　　第三部分實驗:PHM耐缺氧作用
　　將48只昆明小鼠隨機(jī)分為4組，分別給予溶媒及140、280、560 mg/kg的PHM。每天給藥兩次，連續(xù)給藥十四天，給藥時間分別為上午8:00和下午7:00。在末次給藥40 min后，將其放于盛有159鈉石灰的250 mL廣口瓶中，立即用涂有白凡士林的橡膠塞蓋緊瓶口，并開始計時。計時開始后，再在瓶口與橡膠塞交接處迅速、均勻地加涂

11、凡士林，以保證其密閉性。以呼吸停止為指標(biāo)，記錄小鼠的存活時間。按照相同給藥及分組方式，另將48只小鼠在末次給藥40 min后分別腹腔注射400 mg/kg的亞硝酸鈉溶液，并立即計時，以呼吸停止為指標(biāo)，記錄小鼠的存活時間。為了摒除主觀計時影響，兩次試驗中，分組給藥和計時由不同的實驗人員完成。
　　另將40只雄性昆明小鼠隨機(jī)分為4組，按相同方式給藥14天后，取全血，檢測PHM對正常小鼠血紅蛋白水平的影響。
　　研究結(jié)果:

12、　　1.PHM對小鼠慢性疲勞的影響:
　　研究結(jié)果顯示，Home組小鼠體質(zhì)量雖然較Con組小鼠有所增加，但并無顯著差異，此外給予PHM的小鼠體質(zhì)量與Con組相比也未顯示明顯差異，說明PHM對CF小鼠的體質(zhì)量并未造成顯著的影響。在18天的訓(xùn)練過程中，與Con組相比，PHM在第17天的時顯示出明顯的降低小鼠電擊次數(shù)的作用(Con:137.08±53.01 versus PHM280 and560 mg/kg:93.67±40.45 a

13、nd79.00±33.48)。在第19天的力竭疲勞訓(xùn)練中，PHM中、高劑量也能夠明顯減少小鼠受到電擊的次數(shù)(Con:240.08±88.80 versus PHM280 and560 mg/kg:133.17±55.07 and115.08±40.81)。陽性對照藥物莫達(dá)非尼第1天（Con:105.00±59.19 versus modafinil13mg/kg:51.75±26.49）給藥后便能顯著降低小鼠受到的電擊次數(shù)，并且其作用一

14、直持續(xù)到第19天（Con:240.08±88.80 versus modafinil13 mg/kg:85.17±45.04）也未出現(xiàn)耐受現(xiàn)象。
　　與正常飼養(yǎng)組（MG:1.52±0.38; LG:54.13±9.58; SUN:5.54±1.51; CK:0.61±0.24）相比，Con組小鼠的MG與LG水平（MG:0.91±0.26; LG:22.24±2.92）明顯降低，而SUN和CK水平（SUN:7.50±2.09; CK

15、:0.85±0.27）明顯升高。該結(jié)果顯示Con組小鼠體內(nèi)供能物質(zhì)含量降低，致疲勞代謝產(chǎn)物增加。然而，在同等條件下，PHM卻能逆轉(zhuǎn)上述生化指標(biāo)的異常狀況，甚至恢復(fù)至正常水平。其中與Con組相比，PHM560 mg/kg能夠顯著增加MG和LG(MG:1.28±0.24;LG:40.86±10.19)水平，并明顯降低SUN，SLA及CK（SUN:5.77±1.31; SLA:5.67±1.66; CK:0.61±0.19）水平;PHM280

16、 mg/kg能顯著降低SLA和CK含量（SLA:5.56±1.99; CK:0.62±0.34）;PHM140 mg/kg能顯著增加MG與LG（MG:1.19±0.29;LG:32.84±9.5）水平。莫達(dá)非尼雖然在行為學(xué)中能夠快速顯著地降低小鼠受到電擊的次數(shù)，但其不能逆轉(zhuǎn)小鼠疲勞相關(guān)的生化指標(biāo)。
　　2.PHM預(yù)防性抗疲勞作用:
　　各組小鼠經(jīng)過14天給予PHM或溶媒后，其體質(zhì)量的增加并無顯著差異，其結(jié)果與第一部分實驗相似

17、，由此說明PHM并不對小鼠的體質(zhì)量造成顯著的影響。與對照組相比，給予PHM的小鼠在停藥后各次訓(xùn)練中，其電擊次數(shù)明顯降低。并且在停藥后40 min(Con:209.82±20.65 versus PHM280 and560 mg/kg:122.91±21.61 and135.33±22.18)、8 h(Con:247.00±35.02 versus PHM560mg/kg:159.18±22.64)、48 h(Con:172.83±25.

18、77 versus PHM560 mg/kg:96.00±18.00)以及停藥后第72 h(Con:296.18±37.36 versus PHM140，280 and560 mg/kg:206.20±26.72，203.73±29.98and171.73±27.61)的力竭訓(xùn)練中都顯示出了顯著降低電擊次數(shù)的作用。陽性對照藥物莫達(dá)非尼在停藥后40 min（Con:209.82±20.65 versus modafinil13 mg/kg

19、:122.18±104.97）和8h（Con:247.00±35.02versus modafinil13 mg/kg:149.67±93.07）能夠顯著降低小鼠的電擊次數(shù)，但在第24h后，其作用消失。
　　生化指標(biāo)結(jié)果顯示與溶媒組Con組相比，PHM280和560 mg/kg能夠顯著增加小鼠MG(Con:1.26±0.06 versus PHM280 and560:1.49±0.10 and1.48±0.07)和LG(Con:1

20、8.72±1.59 versus PHM280 and560:26.85±2.06 and28.01±2.04)的水平;并且還能夠顯著降低SLA（Con:9.13±0.4 versus PHM280 and560:7.5±0.32 and7.38±0.34）以及CK(Con:0.87±0.06 versus PHM280 and560:0.69±0.06 and0.66±0.56)的含量。PHM140 mg/kg能夠顯著降低小鼠血清SL

21、A(PHM140:7.45±0.33)水平;PHM280 mg/kg能夠顯著降低小鼠血清SUN(PHM280:5.70±0.30)的水平;此外，PHM560 mg/kg還能顯著增加小鼠全血ATP(Con:3.65±0.50 versus PHM560:5.17±0.46)水平。
　　3.PHM耐缺氧作用:
　　在小鼠常壓缺氧存活實驗（Con:23.63±2.01 versus PHM140mg/kg:27.29±1.76;

22、PHM280 mg/kg:28.64±2.11;PHM560 mg/kg:29.51±2.34）和亞硝酸鈉中毒缺氧試驗（Con:7.99±0.67versus PHM140 mg/kg:9.89±1.09; PHM280 mg/kg:10.40±0.58; PHM560 mg/kg:10.28±0.82）中，通過在兩周內(nèi)每天給予小鼠兩次不同劑量的PHM，小鼠的缺氧存活時間顯著增加。在兩次實驗中，與Con組相比，PHM低、中、高劑量組均能

23、顯著增加小鼠缺氧存活時間。然而，PHM不同劑量給藥兩劇后（每天兩次），并沒有對小鼠的血紅蛋白水平造成顯著的影響。
　　結(jié)論:
　　在本次研究中，PHM具有顯著的抗疲勞以及耐缺氧作用。而通過疲勞、缺氧密切相關(guān)的生化指標(biāo)檢測提示了PHM可能通過增加能源物質(zhì)儲備，減少致疲勞代謝產(chǎn)物的累積而起到抗疲勞作用。而其耐缺氧及其它的抗疲勞機(jī)制是否與冬蟲夏草相似，通過減少超氧自由基的積累，并增強(qiáng)機(jī)體清除自由基的能力而起作用，還需要進(jìn)一步驗證。