貢嘎蝙蝠蛾粉擬青霉(Paecilomyces farinosus)遺傳多樣性的SCoT和ISSR標記研究.pdf

1、貢嘎蝙蝠蛾（Hepialus gonggaensis）是形成冬蟲夏草的蟲體之一，在其繁育過程中易被粉擬青霉（Paecilomyces farinosus）侵染而罹患擬青霉病。為研究病原菌的遺傳多樣性，分別采用L12(41×33)混合水平正交實驗設計優(yōu)化SCoT-PCR和ISSR-PCR的反應體系并篩選出最佳反應循環(huán)次數(shù)、引物及相應退火溫度，在此基礎(chǔ)上利用SCoT和ISSR兩種分子標記方法研究了80株粉擬青霉的基因組DNA并進行聚類分析和

2、兩種標記方法的比較。試驗結(jié)果如下：
　　1.粉擬青霉菌遺傳多樣性的SCoT分析
　　優(yōu)化后的粉擬青霉SCoT-PCR反應體系為:20μL體系中，DNA45ng、引物0.7μmol/L、MIX混合液7μL、Taq酶1U，反應體系的最適循環(huán)次數(shù)為40次。應用此反應體系從15個SCoT通用引物中選出條帶多態(tài)性高且清晰的10條引物，分別是S12、S13、S14、S15、S19、S28、S29、S31、S32、S34。分別以80株粉擬

3、青霉DNA為模板，采用上述PCR反應條件進行SCoT-PCR。10條SCoT引物共獲得104個擴增位點，其中多態(tài)性位點69個，多態(tài)性比率為66.35％。對SCoT-PCR的結(jié)果進行聚類分析得出:80株粉擬青霉菌種內(nèi)有著豐富的遺傳多態(tài)性，遺傳相似系數(shù)在0.66-0.95之間，且在0.751處可分為六大類。
　　2.粉擬青霉菌遺傳多樣性的ISSR分析
　　優(yōu)化后的ISSR-PCR反應體系為:20μL體系中，DNA60ng、引物0

4、.6μmol/L、MIX混合液6曲、Taq酶0.8U，反應體系的最適循環(huán)次數(shù)為40次。應用此反應體系從15個ISSR通用引物中選出條帶清晰且多態(tài)性高的10條引物，分別是701、702、703、807、808、809、810、835、855、873。分別以80株粉擬青霉DNA為模板，采用上述PCR反應條件進行ISSR-PCR。10條ISSR引物共獲得96個擴增位點，其中多態(tài)性位點56個，多態(tài)性百分率為58.33％。對ISSR-PCR結(jié)果進

5、行聚類分析得出:80株菌的遺傳相似系數(shù)在0.70-0.96之間，在0.756處可分為五大類。
　　3.粉擬青霉遺傳多樣性的SCoT和ISSR比較分析
　　SCoT擴增的平均條帶數(shù)、多態(tài)性位點數(shù)和多態(tài)性百分率均略高于ISSR標記，說明SCoT標記能檢測出更多的多態(tài)性遺傳位點，略優(yōu)于ISSR分子標記。ISSR標記的遺傳相似系數(shù)的范圍及其平均值，以及將供試菌株分類處的遺傳相似系數(shù)均大于SCoT標記，說明SCoT標記方法比ISSR標

6、記方法具有更高的辨識度。
　　根據(jù)SCoT和ISSR兩種標記方法得出來的兩個聚類結(jié)果可以得出以下結(jié)論:分離自樓房外南面木頭的65號菌單獨分成一大類是因其遺傳距離最遠;同一地方地理來源的菌株沒有全部分到同一類群中，正如分離自樓房南面外墻的12號和26號菌以及分離自樓房北面外墻的20和61號菌分別被分到不同的兩大類群中;分離自二樓實驗室8、9、10、11、14號房以及中央大廳的菌株都被分在不同類群中。來源于同一蟲體或蟲態(tài)的菌株大部分是

7、分在不同類群中，但也有少數(shù)菌株分在同一類。例如分離自貢嘎蛹上的16號和46號菌分別被分到不同的兩大類群中，以及分離自3-4齡貢嘎幼蟲身上的37和62號菌分別被分到不同的兩大類群中。分離自5-6齡貢嘎幼蟲身上的48號和78號菌都歸屬于同一類群;分離自西藏林芝幼蟲身上的1號菌、6-8齡貢嘎幼蟲身上的14號菌和貢嘎蛹上的16號菌都分在了第Ⅰ(1)亞類中。
　　試驗結(jié)果中分離自人工繁育基地不同環(huán)境或蟲態(tài)的蝙蝠蛾粉擬青霉與采集分離自地理遠緣