豬圓形精細(xì)胞顯微注射受精（ROSI）及相關(guān)問題的初步研究.pdf

1、圓形精細(xì)胞卵胞質(zhì)內(nèi)顯微注射(Roundspermatidinjection，ROSI)輔助生殖技術(shù)的出現(xiàn)為治療人類男性不育提供了新的途徑。作為一種動物胚胎工程新技術(shù)，ROSI在提高動物配子利用率，獲取所需性別的動物個體、解決生產(chǎn)能力差的動物受精問題，尤其在作為轉(zhuǎn)基因工程的輔助技術(shù)方面都有重要應(yīng)用。ROSI技術(shù)目前研究并不深入，臨床應(yīng)用成功率非常低，尤其是在動物，僅僅在小鼠、兔、猴等有報道，在豬尚未見產(chǎn)出后代的報道，還處于探索階段。

2、 豬是多胎動物，從豬卵巢上獲得的卵母細(xì)胞數(shù)量雖然較多，但成熟度比較低；由于ROSI技術(shù)是將沒有完全發(fā)育成熟的單一圓形精細(xì)胞直接注入卵胞質(zhì)內(nèi)，跳越了精子在穿過透明帶和卵質(zhì)膜等過程中所發(fā)生的生理和生化反應(yīng)；如果卵胞質(zhì)成熟或活化程度不夠，加之圓形未成熟精細(xì)胞成熟度比較差等原因，很可能造成ROSI受精的卵母細(xì)胞內(nèi)部激活因子蓄積減少和生成不足，引起精核解聚困難、精圓核不能形成、第二極體不能排出、卵母細(xì)胞孤雌發(fā)育率增加等，使ROSI顯微受精失敗。

3、本試驗旨在結(jié)合豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)及ROSI相關(guān)操作，建立卵胞質(zhì)內(nèi)圓形精細(xì)胞顯微注射受精技術(shù)程序，探索豬圓形精細(xì)胞顯微受精的可能性，研究影響這種特殊細(xì)胞顯微注射受精效果的因素，為進一步研究豬ROSI技術(shù)提供基礎(chǔ)資料。 本試驗首先研究了成熟培養(yǎng)液中添加激素對豬卵母細(xì)胞體外成熟過程中染色體構(gòu)型和成熟率的影響，以探索豬卵母細(xì)胞體外成熟規(guī)律，提高體外培養(yǎng)成熟度，為ROSI技術(shù)體系準(zhǔn)備優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞；然后針對豬圓形精細(xì)胞的體外分離進行了試

4、驗，進而通過對ROSI操作和ICSI(Intracytoplasmicsperminjection，ICSI)操作的比較研究了影響ROSI操作的因素。研究結(jié)果如下： 試驗1：用H33342染色觀察COCs在將卵母細(xì)胞分別在三種不同培養(yǎng)環(huán)境中(FSH→不含激素、FSH→LH、FSH+LH→不含激素?！啊北硎驹谂囵B(yǎng)的第22～24h換液)其核、質(zhì)成熟情況。前段培養(yǎng)24h時，含F(xiàn)SH組和含F(xiàn)SH+LH組間除了MI期卵母細(xì)胞出現(xiàn)比率差異

5、顯著(9.38﹪vs15.73﹪；P＜0.05)外，其余各分裂階段的分布差異不顯著，但在含F(xiàn)SH中培養(yǎng)24h后，GVI期卵母細(xì)胞出現(xiàn)比例低于FH+LH組(12.5﹪vs20.22﹪，P＞0.05)，而GVIV期卵母細(xì)胞出現(xiàn)比例則高于FSH+LH組(17.19vs8.99﹪，P＞0.05)。激素對卵母細(xì)胞IVM成熟比率的影響：培養(yǎng)48h后，F(xiàn)SH+LH→不含激素組的MII期卵母細(xì)胞的出現(xiàn)比率顯著高于FSH→不含激素組和FSH→LH組(55

6、.45﹪vs20.45﹪、36.62﹪，P＜0.05)；FSH→不含激素組GV期卵母細(xì)胞的比例顯著高于其余兩組(22.73﹪vs9.86﹪、4.95﹪，P＜0.05)；結(jié)果表明，豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)中，前24h添加FSH+LH的成熟培養(yǎng)液能夠增加GVI期、減少GVIV期卵母細(xì)胞的比例，提高了卵母細(xì)胞的發(fā)育潛力；而且，前24h使用含有FSH+LH的成熟液，后24h使用不含激素體外成熟液能夠獲得較好的卵母細(xì)胞成熟比率。 試驗2：圓

7、形精細(xì)胞分離方法研究。使用組合酶處理與單一使用膠原酶和胰蛋白酶分離圓形精細(xì)胞所耗時間差異極顯著(65.3min、83minvs112.7min，P＜0.01)；三種酶處理組獲得圓形精細(xì)胞數(shù)量近似，差異不顯著，但組合酶組稍高于單一酶處理組(7.03×105vs6.41×105、5.93×105，P＞0.05)；然而，組合酶組獲得的圓形精細(xì)胞活率略低于單一酶處理組，差異不顯著，其活率高低依次是胰蛋白酶組＞膠原蛋白酶組＞組合酶組(34.19﹪

8、＞33.36﹪＞26.96﹪)；結(jié)果表明酶消化法中用胰蛋白酶處理睪丸組織效果較好。 在試驗中用胰蛋白酶處理與睪丸直接穿刺法比較發(fā)現(xiàn)，胰蛋白酶處理法在花費時間、獲取圓形精細(xì)胞數(shù)量都極顯著高于睪丸直接穿刺法(83minvs25.67min、6.41×105vs30，P＜0.01)，睪丸穿刺法在獲得成活圓形精細(xì)胞的比率上極顯著高于酶處理法(100﹪vs34.19﹪，P＜0.01)。針對酶處理法和睪丸直接穿刺法獲取圓形精細(xì)胞進行ROSI

9、相比較，直接睪丸穿刺法更適合試驗室操作，而酶處理法更適宜于大批量圓形精細(xì)胞的制備。 試驗3：激活時序?qū)ωi圓形精細(xì)胞顯微注射(ROSI)效果的影響。經(jīng)過試驗確定睪丸組織中平均直徑為9.4±0.1μm的類圓形細(xì)胞為圓形精子細(xì)胞；選取這種細(xì)胞進行顯微注射受精(ROSI)發(fā)現(xiàn)，對成熟卵母細(xì)胞實施注射前、后兩次激活的處理組出現(xiàn)了卵裂。 試驗4：ROSI和ICSI技術(shù)操作程序和試驗效果比較。運用常規(guī)的ICSI操作程序，對雄性配子的前

10、期準(zhǔn)備平均時間顯著長于ROSI雄性配子的準(zhǔn)備時間(37minvs25.67min，P＜0.05)；平均每個卵子完成注射時間ICSI組顯著長于ROSI組(7.33minvs3.33min，P＜0.05)；操作成功率無顯著差異，但ICSI組稍高于ROSI組(90﹪vs79.49﹪，P＞0.05)。對豬圓形精細(xì)胞和精子進行卵胞質(zhì)顯微操作后，統(tǒng)計卵裂出現(xiàn)率，ICSI組卵裂率極顯著高于ROSI組(38.89﹪vs3.23﹪，P＜0.01)。結(jié)果表

11、明ROSI操作相對ICSI簡單，但卵裂率明顯低于ICSI。 綜上所述，在本試驗室條件下，豬卵母細(xì)胞在含有FSH+LH的成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)22-24h，然后轉(zhuǎn)入不含激素的培養(yǎng)液中培養(yǎng)至48h，能取得較高的成熟率；在圓形精細(xì)胞的獲取方面，直接睪丸穿刺法更適合試驗室操作，而酶處理法更適宜于生產(chǎn)；采用單一胰蛋白酶處理睪丸細(xì)胞懸液獲取圓形精細(xì)胞是操作比較方便、效率相對較高的方法。試驗證明豬圓形精細(xì)胞顯微注射受精(ROSI)在本試驗室條件下能