探究纖連蛋白和解聚素—金屬蛋白酶-8在椎間盤退變中的關(guān)系.pdf

1、背景:
　　椎間盤退變是腰背痛的主要原因之一，是多因素協(xié)同共同作用的結(jié)果，椎間盤退變已成為臨床上的常見問題，不僅給患者帶來極大的痛苦，同時也消耗了大量醫(yī)療資源。然而椎間盤產(chǎn)生退變的病理機(jī)制尚不完全清楚，現(xiàn)階段大部分病人通過手術(shù)治療來緩解疼痛癥狀。椎間盤的退變過程不僅僅表現(xiàn)在形態(tài)學(xué)上的變化，更伴隨著椎間盤的組織學(xué)和生化性質(zhì)的系統(tǒng)性改變，其中椎間盤組織細(xì)胞外基質(zhì)成分的丟失，導(dǎo)致結(jié)合水能力下降和蛋白降解這兩種因素尤為重要。近年來隨著實驗

2、設(shè)備的改良和實驗手段的改進(jìn)，對椎間盤組織的分子生物學(xué)、免疫學(xué)、病理生理學(xué)及生物力學(xué)等方面研究不斷深入，這些研究將引導(dǎo)出治療椎間盤退變的新理論和方法。
　　纖連蛋白(Fibronectin FN)，是在細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和血漿中發(fā)現(xiàn)的一種多功能糖蛋白，整個分子呈V形，它至少有20中變異體存在，這些亞單位為同一基因的表達(dá)產(chǎn)物，只是在轉(zhuǎn)錄后RNA的剪接上有所差異，因而產(chǎn)生不同的mRNA。纖連蛋白廣泛分布于血漿、多種細(xì)胞表面及細(xì)胞外基質(zhì)

3、中。它在細(xì)胞黏附和遷移，細(xì)胞分化，細(xì)胞功能中起著重要的作用，具有多種生物活性。近年來對纖連蛋白和纖連蛋白片段在慢性疾病中的作用相關(guān)研究逐漸增多。
　　解聚素-金屬蛋白酶家族（A Disintegrin And MetalloproteinaseFamily），為1型跨膜蛋白（含鋅蛋白酶總家族），也叫去整合素-金屬蛋白酶或者M(jìn)DC。是錨定在細(xì)胞膜的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)家族。在調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的水解，細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)的相互作用中至關(guān)重要

4、。該家族涉及到膜融合（細(xì)胞粘連和細(xì)胞融合），細(xì)胞因子和生長因子的脫落，細(xì)胞遷徙的控制，以及某些進(jìn)程肌肉發(fā)育，受精和細(xì)胞結(jié)局的決定。病理學(xué)中，炎癥和腫瘤也受到該家族影響。
　　纖連蛋白在關(guān)節(jié)和軟骨中的作用已經(jīng)被廣泛研究，但其在椎間盤退變中的作用相關(guān)研究不多，認(rèn)為FN以及FN-f含量的變化與椎間盤退變過程有關(guān)。相關(guān)研究表明ADAM-8在關(guān)節(jié)軟骨中能夠在特定位點將FN剪切為含有N-末端到VRAA271位點的FN-f,從而使該FN-f含量

5、不斷積累增加，F(xiàn)N失去原有的生物作用和功能而加重軟骨退變過程。由于軟骨和椎間盤組織細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的相似性，通過對人椎間盤組織和ADAM-8轉(zhuǎn)基因老鼠進(jìn)行相關(guān)實驗來探究ADAM-8和FN在椎間盤退變發(fā)生和發(fā)展過程中的關(guān)系。從而為治療椎間盤退變疾病提供一些新研究方向和治療方法。
　　第一部分，ADAM-8對于人椎間盤樣品中的FN作用和影響
　　目的:
　　通過手術(shù)病人和器官捐贈者的椎間盤樣品，進(jìn)行體外實驗確定在人椎間盤不

6、同退變等級中ADAM-8基因的表達(dá)對纖連蛋白以及纖連蛋白片段的作用和影響。
　　方法:
　　1.人椎間盤樣品的選擇和收集。選取脊柱手術(shù)病人和器官捐贈者的椎間盤NP和AF組織在含有蛋白酶抑制劑的1*PBS洗滌后低溫在-80℃冰箱保存。
　　2.人椎間盤組織中定性定量蛋白質(zhì)檢測(Western Blot)，在不同等級人椎間盤退變組織中檢測全長FN和特定FN-f以及它們的含量變化。
　　3.通過定性蛋白質(zhì)檢測和免疫組化

7、方法來觀測人椎間盤中ADAM-8的存在和分布情況。
　　結(jié)果:
　　1.在人椎間盤組織中，纖連蛋白N-末端抗體(MAB1936)和(VRAA271位點)能特異性識別全長FN以及含有N-末端到VRAA271位點的FN-f。
　　2.在人椎間盤組織中特定纖連蛋白片段的含量隨著椎間盤退變程度增加而上升。
　　3.通過Western blot定性檢測和免疫組化染色觀測到ADAM-8存在于成年人椎間盤NP和AF組織中，并且

8、能在特定位點剪切FN。
　　4.在人椎間盤組織中成熟ADAM-8含量隨著椎間盤退變級別增加而上升。
　　結(jié)論:
　　1.通過實驗在人椎間盤組織中首次鑒定了含有N-末端到VRAA271位點的纖連蛋白片段。
　　2.在人椎間盤組織中發(fā)現(xiàn)FN-f含量隨著椎間盤退變程度增加而上升。
　　3.們在人椎間盤中通過蛋白定性檢測確定了ADAM-8的存在，并且發(fā)現(xiàn)其能夠在特定位點將FN剪切為FN-f。
　　4.通過研究

9、，在人椎間盤組織中，成熟ADAM-8含量隨著椎間盤退變級別增加而上升，與FN-f含量變化趨勢相同。表明FN-f和ADAM-8在椎間盤退變的發(fā)生和發(fā)展過程中有重要作用。
　　第二部分，兩種轉(zhuǎn)基因小鼠椎間盤體內(nèi)實驗觀測ADAM-8對纖連蛋白的作用和影響
　　目的:
　　通過ADAM-8轉(zhuǎn)基因老鼠體內(nèi)實驗進(jìn)一步確定，在椎間盤退變中ADAM-8基因的表達(dá)對纖連蛋白以及纖連蛋白片段的作用和影響。
　　方法:
　　1.

10、在固定時間點收集敲除型(KO)和野生型(WT)兩種基因型的ADAM-8轉(zhuǎn)基因小鼠腰椎間盤樣品，從組織學(xué)染色觀測兩者椎間盤退變過程。
　　2.定性蛋白檢測來研究ADAM-8和FN-fs在椎間盤退變發(fā)生和發(fā)展過程中的作用。
　　結(jié)果:
　　1.HE染色組織學(xué)定期觀測結(jié)果顯示，ADAM-8野生型(WT)型轉(zhuǎn)基因小鼠椎間盤退變程度明顯高于ADAM-8敲除型(KO)型轉(zhuǎn)基因小鼠。
　　2.Western blot蛋白檢測顯