組織工程技術(shù)制備人膝半月板組織的初步研究.pdf

1、半月板是膝關(guān)節(jié)的重要結(jié)構(gòu)之一,具有承受和傳導(dǎo)載荷、吸收震蕩、潤滑關(guān)節(jié)和穩(wěn)定關(guān)節(jié)等作用<'[1.2.3]>.半月板因創(chuàng)傷和先天性畸形在骨科臨床工作中相當(dāng)多見<'[4]>,目前的治療手段多半是手術(shù)切除或部分切除損傷或畸形的半月板<'[4.5]>,解除患者的病痛,取得了相當(dāng)滿意的效果,因為如果不進行手術(shù)治療,任其病情自然發(fā)展,往往導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)晚期骨性關(guān)節(jié)炎的出現(xiàn),手術(shù)切除或部分切除半月板雖然是目前治療半月板損傷或畸形的主要手段,但其遠期效果并非

2、十全十美,仍然有一些不盡人意的并發(fā)癥出現(xiàn)<'[6.7]>,所以,隨著組織工程技術(shù)<'[59]>的出現(xiàn),人們追求更加完美的手段來替代現(xiàn)有的治療措施,組織工程技術(shù)是人們試圖用來改變現(xiàn)有治療手段的方法之一<'[8.9.10.11]>.該實驗設(shè)計從損傷或畸形的半月板組織中獲取纖維軟骨細胞作為種子細胞,在體外單層培養(yǎng)并在各種細胞因子作用下大量增殖分化,產(chǎn)生大量的種子細胞,同時檢測種子細胞的生物學(xué)特性<'[12.13]>,之后,擬將種子細胞與支架結(jié)

3、合,種植于裸鼠皮下,構(gòu)建出組織工程化人膝關(guān)節(jié)半月板,最后檢測組織工程化半月板的生物學(xué)特性,并比較組織工程化半月板與半月板之間的差異.內(nèi)容:1.種子細胞的優(yōu)化獲取的方法:從手術(shù)中切除下來無變形或嚴(yán)重炎癥反應(yīng)的半月板組織,經(jīng)胰蛋白酶,透明質(zhì)酸酶和膠原酶的消化而獲取人膝關(guān)節(jié)半月板纖維軟骨細胞,進行原代和傳代單層培養(yǎng).2.測定原代和傳代的纖維軟骨細胞的生物學(xué)特性:研究方法包括細胞倒置顯微鏡下的形態(tài)表現(xiàn),細胞計數(shù),HE染色,免疫組化染色,細胞貼壁

4、率,生長曲線,各種細胞因子作用下纖維軟骨細胞的增殖情況如細胞數(shù)目的增加、總RNA含量的測定、特異性mRNA表達等.3.構(gòu)建組織工程化人膝關(guān)節(jié)半月板,將不同代次的纖維軟骨細胞與支架結(jié)合,體外培養(yǎng)一段時間后植入裸鼠皮下,在不同的時間段,分別取出,測定其生物學(xué)特性,并與正常半月板的生物學(xué)特性進行比較,因此檢驗組織工程化半月板是否能滿足臨床需要.結(jié)果:1.手術(shù)中切下的無炎癥反應(yīng)或沒有變性的人膝關(guān)節(jié)半月板組織可以作為種子細胞的來源之一<'[14]

5、>,通過酶消化法<'[15.16]>,能夠獲取大量的種子細胞,作為組織工程種子細胞的主要來源,滿足實驗的要求.2.纖維軟骨細胞的生物學(xué)特性:(1)纖維軟骨細胞的貼壁率隨著接種時間的延長,貼壁率逐漸增加,原代和傳代細胞之間的貼壁率有明顯的差異,適宜的接種密度適合于細胞增殖分化接種密度0.4×10<'4>/cm<'2>細胞增殖緩慢,而接種密度大于4×10<'4>/cm<'2>無助于提高小貼壁率;含10﹪小牛血清的DMEM-F<,12>培養(yǎng)劑

6、適合于細胞增殖分化,提高血清濃度并不能增加細胞的貼壁率;(2)纖維軟骨細胞的生長曲線符合一般的規(guī)律<'[17]>,接種后第一天都有微小的下降,之后逐漸上升,達到平臺期,接著緩慢下降.(3)Ⅰ、Ⅱ型膠原mRNA表達:體外單層培養(yǎng)的半月板纖維軟骨細胞能表達Ⅰ、Ⅱ型膠原mRNA,在各種細胞因子刺激之下mRNA表達上調(diào),總RNA量比未受細胞因子刺激的情況下多.兩者有明顯的差異(P<0.05).(4)甲苯胺藍染色顯示蛋白多糖主要是GAG的合成.3

7、.組織工程化半月板外觀形態(tài)具有接近正常半月板的結(jié)構(gòu),剖面結(jié)構(gòu)致密,纖維排列縱橫交錯,組織切片可以明顯顯示出纖維軟骨細胞,免疫組化檢測可以測出Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白的形成,MRI檢測具有接近正常半月板的低信號影像特征<'[18.19]>.結(jié)論:1.手術(shù)中切除下來的半月板組織可以作為組織工程培養(yǎng)的種子細胞的來源之一,經(jīng)過優(yōu)化獲取可以得到大量的種子細胞.2.體外單層培養(yǎng)的半月板纖維軟骨細胞具有正常細胞的生物學(xué)特性,符合作為種子細胞的多種生物學(xué)要求.