甘藍(lán)型油菜矮化突變體“NDF-1”抑制性消減文庫的構(gòu)建和BnD5、BnD11基因全長cDNA的克隆.pdf

1、為了探究矮化性狀突變的分子機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用抑制性消減雜交(suooression subtractive hybridization，SSH)技術(shù)構(gòu)建了甘藍(lán)型油菜矮化突變體“NDF-1”的抑制性消減文庫。經(jīng)菌落PCR檢測，消減文庫的有效重組率為90％，其中插入的cDNA片段大小在100bp到1000bp之間。再通過斑點(diǎn)雜交對(duì)100個(gè)隨機(jī)挑選的含有插入片段的陽性克隆進(jìn)行初步地差異篩選，然后選取32個(gè)陽性克隆進(jìn)行序列測定。用DNAMAN序列

2、分析軟件對(duì)測序結(jié)果分析比較，cDNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比較。結(jié)果顯示，有3個(gè)克隆未出現(xiàn)測序結(jié)果；在另外的29個(gè)克隆中，4號(hào)和11號(hào)克隆完全重復(fù)，6號(hào)和12號(hào)克隆完全重復(fù)，非重復(fù)率為86.2％，其中，17個(gè)序列與己知蛋白或推測蛋白質(zhì)(putativeprotein)有著較高的同源性，功能涉及到以下幾方面：第二信使、轉(zhuǎn)錄因子、衰老、蛋白質(zhì)降解、脂肪酸代謝、脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)及儲(chǔ)存，其余的12個(gè)克隆與未知蛋白質(zhì)(unknown p

3、rotein)或假想蛋白質(zhì)(hypothetical protein)同源，暫不能確定功能。 以甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)矮化突變體“NDF-1”苔期的頂端和側(cè)生幼葉為材料提取RNA，在已經(jīng)構(gòu)建的油菜矮化突變體“NDF-1”消減文庫中選取一個(gè)已經(jīng)測序的編碼半胱氨酸蛋白酶的基因片段和一個(gè)編碼植物特有的轉(zhuǎn)錄因子WRKY的基因片段，設(shè)計(jì)特異引物并應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA和RACE-PCR技術(shù)，克隆得到這兩個(gè)基因片段的c

4、DNA全序列，分別命名為 BnD5和BnDll。序列分析表明，BnD5cDNA的開放閱讀框?yàn)?080bp，編碼359個(gè)氨基酸；BnDllcDNA的開放閱讀框?yàn)?10bp，編碼269個(gè)氨基酸。對(duì)推測的氨基酸序列的組成、同源性進(jìn)行了分析。發(fā)現(xiàn)推測的BnD5氨基酸序列與甘藍(lán)中一個(gè)功能為半胱氨酸蛋白酶的蛋白質(zhì)有較高的同源性(96％)，BnDll氨基酸序列與AtWRKY有很高的同源性。隨后又對(duì)它們的活性位點(diǎn)、親水性以及二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步預(yù)測，Bn