甘藍(lán)型油菜stb1突變體曲莖性狀的QTL定位與轉(zhuǎn)錄組分析.pdf

1、油菜作為世界四大油料作物之一，也是我國主要的油料、飼料和能源作物，常年播種面積和總產(chǎn)量居世界首位。隨著油菜產(chǎn)量和品質(zhì)的提高，單株結(jié)實(shí)量不斷增大，油菜倒伏已成為一個普遍性的問題。理想株型可提高光能利用率，發(fā)掘與利用甘藍(lán)型油菜多樣化的性狀（基因），對培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和高效的油菜品種是十分必要的。曲莖的特異株型性狀在油菜育種中具有潛在的利用價值。同時甘藍(lán)型油菜曲莖莖稈生長異常導(dǎo)致突變，分離其基因可對植物莖稈生長發(fā)育的遺傳機(jī)制進(jìn)行深入的了解。本研

2、究利用甘藍(lán)型油菜曲莖突變體stb1（stem bending1）與中雙11（ZS11）雜交的F1和F2群體進(jìn)行曲莖性狀的遺傳分析和QTL定位，結(jié)合油菜60K SNP芯片和基于全基因組重測序的QTL-Seq方法對該基因進(jìn)行定位。對 stb1突變體彎曲莖稈及 ZS11正常莖稈進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq），分析定位區(qū)間內(nèi)的差異表達(dá)基因，并根據(jù)stb1和ZS11全基因組重測序結(jié)果獲得在兩個材料間存在非同義突變的差異表達(dá)基因作為候選基因。

3、r>　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴對GH06×ZY821高世代重組自交系中篩選的自然突變曲莖材料 stb1與對照ZS11進(jìn)行了表型比較。結(jié)果表明，莖稈發(fā)生彎曲的關(guān)鍵時期大約為初花期前10 d至初花后5 d，即蕾薹末期至初花期。冷凍切片及電鏡掃描均觀察到初花期stb1莖稈木質(zhì)部、導(dǎo)管數(shù)量、厚壁組織和薄壁細(xì)胞發(fā)達(dá)程度遠(yuǎn)低于對照ZS11；利用GC-MS測定stb1木質(zhì)素單體發(fā)現(xiàn)，S/G木質(zhì)素比例較ZS11顯著降低；上述表型觀察證實(shí)與對照ZS11相

4、比，stb1的維管系統(tǒng)發(fā)育異常，木質(zhì)素組分也有較大改變。蕾薹前期即莖稈彎曲表型出現(xiàn)前，對stb1突變體進(jìn)行打頂及對莖尖生長點(diǎn)噴施生長素，處理后的新生主莖均恢復(fù)直立，且打頂處理的側(cè)枝出現(xiàn)彎曲，提示stb1的表型可能與生長素的代謝或極性運(yùn)輸異常（polar auxin transport，PAT）有關(guān)。⑵創(chuàng)建stb1與ZS11正反交F1群體，對群體植株表型調(diào)察結(jié)果表明，所有后代植株莖稈均與ZS11相同，未發(fā)生彎曲，推測stb1突變體由隱性基

5、因控制。為分析其遺傳規(guī)律，考察了F2群體273個單株的莖稈彎曲性狀，結(jié)果發(fā)現(xiàn)曲莖后代彎曲程度存在差異，且不同材料彎曲起始高度不完全相同。F2群體中有215株莖稈表型正常，58株莖稈彎曲；卡方測驗(yàn)結(jié)果顯示，卡方檢測值χ2=2.05＜χ2(0.05)=3.84，無顯著差異，直莖與曲莖符合3：1的表型分離比例，表明stb1突變體的遺傳規(guī)律符合孟德爾常染色體隱性單基因遺傳。⑶利用F2分離群體，根據(jù)表型選擇30個曲莖和64個直莖的F2植株，將其與

6、兩個親本材料一起提取DNA，利用甘藍(lán)型油菜60K SNP芯片進(jìn)行基因型鑒定。在檢測的52157個SNP位點(diǎn)中，共有47139個SNP標(biāo)記能夠?qū)?0個以上的樣品進(jìn)行基因型分析，表明SNP芯片雜交檢測成功，適合用于后續(xù)分析。對親本材料ZS11和stb1突變體的差異基因型分析發(fā)現(xiàn)，共有16159個SNP標(biāo)記在親本間存在基因型差異，其中適合用于遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、無明顯偏分離的純合差異SNP標(biāo)記位點(diǎn)共11721個。結(jié)合94個F2植株的SNP基因型

7、數(shù)據(jù)，采用Joinmap4.0構(gòu)建了一張包含19個連鎖群的遺傳連鎖圖，包括1840個SNP位點(diǎn)，覆蓋基因組長度為1821.72 cM，標(biāo)記間平均遺傳距離為0.99 cM。利用WinQTL Cartographer2.5進(jìn)行單標(biāo)記 SNP位點(diǎn)分析，最終將 STB1基因定位于 A01染色體 Bn-A01-p2421445與Bn-A01-p3939508標(biāo)記之間，定位區(qū)間遺傳距離為1.802 cM。根據(jù)定位區(qū)間上所有SNP標(biāo)記與法國公布的甘藍(lán)

8、型油菜基因組序列進(jìn)行 BLASTN比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn) Bn-A01-p2421445與Bn-A01-p4230829在基因組上的距離為1.995 Mb。⑷利用RNA-Seq對ZS11和stb1突變體莖稈的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了分析，結(jié)果共鑒定出3073個差異表達(dá)基因，其中在stb1中上調(diào)表達(dá)的基因1424個，下調(diào)表達(dá)基因1649個。利用BinGO對差異表達(dá)基因分別進(jìn)行GO富集分析發(fā)現(xiàn)，stb1突變體下調(diào)基因主要集中在磷酸肌醇生物合成、長日照光周期、多

9、元醇生物合成、生長素極性運(yùn)輸和紫外線響應(yīng)等生物學(xué)功能，與PAT有關(guān)的基因共有29個。此外，與細(xì)胞分化和根分生組織形態(tài)有關(guān)的SAUR41、與莖稈節(jié)間伸長及維管束發(fā)育相關(guān)的ACL5和調(diào)節(jié)質(zhì)外體pH值以影響生長素輸出蛋白定位的AVP1等基因在stb1突變體中也顯著下調(diào)。stb1突變體中與木質(zhì)素生物合成相關(guān)的基因PAL1、PAL2、PAL4、C4H、4CL5和COMT1表達(dá)量均顯著下調(diào)。在確定的定位區(qū)間Bn-A01-p2421445與Bn-A0

10、1-p4230829標(biāo)記區(qū)間及200kb側(cè)翼序列范圍內(nèi)，發(fā)現(xiàn)有5個下調(diào)表達(dá)基因與生長素合成、運(yùn)輸和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，很可能為STB1基因的候選基因，其中APM1和CCD8參與PAT，ARF16和IAA11參與生長素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，PRHA受生長素正向調(diào)控，并與維管組織發(fā)育關(guān)系密切。⑸基于stb1和ZS11的全基因組重測序數(shù)據(jù)，以公布的油菜基因組序列為參考序列，分析了在Bn-A01-p2421445與Bn-A01-p4230829定位區(qū)間的InD