LAIR家族分子、Ep-CAM及其相互作用.pdf

1、該實(shí)驗(yàn)主要包括以下五個(gè)部分.第一,通過(guò)RT-PCR,從白血病細(xì)胞系Jurkat和HL-60中獲得了4種新的LAIR-1異型,按照分子量的大小和來(lái)源分別命名為L(zhǎng)-1、L-2、H-1和H-2.其中,L-1、H-1和H-2具有完整的開(kāi)放讀框,L-1和H-2包含了LAIR的Ig結(jié)構(gòu)域.LAIR-1異型可能與白血病中異常的選擇性剪切相關(guān).第二,構(gòu)建了LAIR-1胞膜外區(qū)真核(LAIR-1-myc)和原核(LAIR-1-GST)表達(dá)質(zhì)粒,表達(dá)了相應(yīng)

2、蛋白.分別通過(guò)抗c-myc單抗交聯(lián)的Sepharose 4B和谷胱甘肽交聯(lián)的Sepharose 4B純化,制備了LAIR-1多抗.Western Blot證實(shí)了HL-60中表達(dá)小分子量的LAIR相關(guān)蛋白.第三,通過(guò)RT-PCR從腎綜合征出血熱患者PBMC中克隆了LAIR-2cDNA.構(gòu)建了原核(LAIR-2-GST)和真核(LAIR-2-myc)融合蛋白基因并表達(dá)和純化.應(yīng)用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù),制備了4株能夠與真核蛋白反應(yīng)的單克隆抗體,

3、抗體腹水效價(jià)為10<'-6>.并建立了夾心ELISA檢測(cè)LAIR-2方法.第四,通過(guò)RT-PCR從直腸癌和乳腺癌腫瘤組織中克隆了Ep-CAMcDNA.構(gòu)建了Ep-CAM-GST融合蛋白表達(dá)基因并表達(dá)和純化,制備了15株單克隆抗體.不同的Ep-CAM mAb在免疫組化方面的染色情況不同,2A9只著染腺體細(xì)胞膜,而4B11則能夠著染腺上皮的細(xì)胞膜、核膜以及間質(zhì)中的炎性細(xì)胞.第五,利用ELISA和共聚焦的方法鑒定了LAIR-1、LAIR-2和

4、Ep-CAM之間作用的表位和相互作用的關(guān)系.通過(guò)Ep-CAM特異性單抗的阻斷實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)了LAIR-1和LAIR-2識(shí)別的表位不同.其中,2A9能夠同時(shí)阻斷LAIR-1和LAIR-2與Ep-CAM結(jié)合,2D5、2D7和2H6只選擇性地阻斷LAIR-1與Ep-CAM結(jié)合,3A6能夠顯著提高LAIR-2與Ep-CAM結(jié)合的親和力.通過(guò)LAIR-1和LAIR-2分別與Ep-CAM結(jié)合后,再加入LAIR-1和LAIR-2HRP標(biāo)記的單抗,發(fā)現(xiàn)FM