Survivin在糖尿病小鼠胰腺中的表達(dá)及其過表達(dá)對NIT-1細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、本文內(nèi)容分為兩部分：研究STZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠模型胰腺survivin基因的表達(dá)情況；同時給予STZ小鼠Ex處理，了解Ex對survivin表達(dá)的影響以及survivin是否與Ex抗凋亡有關(guān)。另一方面，利用分子生物學(xué)技術(shù)，將survivin基因?qū)胍葝u素分泌細(xì)胞，使胰島素分泌細(xì)胞高度表達(dá)survivin，然后暴露于凋亡誘導(dǎo)因子的環(huán)境，以探求survivin是否具有保護胰島素分泌細(xì)胞的作用。 第一部.分鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病小鼠模型胰

2、腺survivin基因的表達(dá)及exendin-4對其的影響 一、研究目的 建立連續(xù)多次小劑量STZ注射誘導(dǎo)糖尿病小鼠模型，探討STZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠成模過程中的不同時間點胰腺survivin基因mRNA的表達(dá)情況，并了解Ex對其的影響。 二、研究方法 1、實驗動物分組與處理：6周齡雄性Balb/c小鼠穩(wěn)定飼養(yǎng)1周后隨機分為三組：(1)STZ組第1-5天腹腔注射STZ40mg/kg，STZ注射前2天始連續(xù)10

3、天腹腔注射生理鹽水。(2)Ex組第1-5天腹腔注射STZ40mg/kg，STZ注射前2天始連續(xù)10天腹腔注射Ex24mol/kg。(3)對照組注射溶劑。每周測量體重、隨機血糖，并于各時段取胰腺組織，-80℃保存或4％多聚甲醛固定。 2、胰腺組織HE染色、胰島素和survivin的免疫組化檢測 3、TUNEL檢測胰島細(xì)胞凋亡 4.實時熒光PCR檢測胰腺組織survivin基因mRNA水平 5、RT-PCR產(chǎn)

4、物進行核苷酸序列測定。 三、結(jié)果 1、小鼠體重、血糖的變化：對照組小鼠體重呈持續(xù)增加(P＜0.05)。STZ組小鼠體重在4周內(nèi)無明顯改變(F=1.591，P=0.178)。與基礎(chǔ)值比較，Ex組體重在第1周時下降，在第3、4周逐漸回升，但均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。不同時間點的三組小鼠比較，處理前各組小鼠的體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；STZ組第1、3、4周體重均低于同齡的對照組(P＜0.05)；Ex組第1周體

5、重低于同齡的對照組(P＜0.05)，而在繼后的第2、3、4周時與對照組的差異未達(dá)統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；第3和4周時Ex組的小鼠體重有高于STZ組的趨勢，但P＞0.05。 2、胰腺組織學(xué)、免疫組織化學(xué)檢測：HE染色示STZ組胰島少而小。胰島中胰島素染色陽性面積百分比在對照組、STZ組和Ex組中分別為46.32±9.26％、25.47±9.26％和39.40±9.72％。三組間差異顯著(F=57.02，P＜0.01)。兩兩比較

6、，STZ組小于對照組，Ex組大于STZ組，但小于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。三組胰島中均可見survivin染色陽性的細(xì)胞，胰腺外分泌腺及導(dǎo)管未見陽性染色。 3、TUNEL檢測結(jié)果：正常對照組小鼠胰島細(xì)胞凋亡數(shù)目很少，STZ注射可誘導(dǎo)小鼠胰島細(xì)胞凋亡增加，STZ注射后4周Ex組胰島細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著少于STZ組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。 4、實時熒光PCR檢測胰腺組織survivin基因mRNA

7、水平：對照組胰腺survivinmRNA水平穩(wěn)定(P＞0.05)。STZ組1、2周survivinmRNA表達(dá)量與基礎(chǔ)持平(P＞0.05)，第3、4周高于基礎(chǔ)水平，也高于同時間點對照組水平，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。Ex組survivinmRNA表達(dá)量在第2周時無明顯變化(P=0.94)，4周時升高，也高于同時期對照組和STZ組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。 5、RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)測序表明與小鼠survivin

8、基因序列100％吻合。 四、結(jié)論 1、STZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠在STZ注射后3、4周胰腺survivinmRNA水平明顯升高，提示survivin表達(dá)上調(diào)可能與胰島β細(xì)胞修復(fù)再生有關(guān)。 2、Exendin-4可改善STZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠的高血糖，增加胰島中胰島素染色陽性面積百分比，減少胰島細(xì)胞凋亡，上調(diào)胰腺survivin表達(dá)，survivin可能在exendin-4抑制胰島β細(xì)胞凋亡途徑中起一定作用。 第二部

9、分.轉(zhuǎn)染survivin基因?qū)IT-1細(xì)胞凋亡的影響一、研究目的轉(zhuǎn)染小鼠survivin基因到小鼠胰島素分泌細(xì)胞系NIT-1細(xì)胞，研究過表達(dá)survivin基因?qū)?xì)胞因子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響，并了解其對NIT-1細(xì)胞葡萄糖刺激的胰島素分泌功能的影響。 二、實驗方法 1、pcDNA3.0-GFP-Sur真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 2、重組pcDNA3.0-GFP-Sur質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NIT-1細(xì)胞，并進行鑒定

10、 3、細(xì)胞培養(yǎng)：實驗采用小鼠胰島素分泌細(xì)胞系NIT-1細(xì)胞(20-40代)，分為對照組、轉(zhuǎn)染GFP組和轉(zhuǎn)染GFP+小鼠survivin基因組。每大組再分為細(xì)胞因子干預(yù)亞組和非干預(yù)亞組，細(xì)胞因子干預(yù)組在細(xì)胞融合至50-70％時予IL-1β100U/ml+IFN-γ1000U/ml孵育48h。共6組如下：C組(NIT-1細(xì)胞)、CC組(NIT-1細(xì)胞、細(xì)胞因子干預(yù))、GFP組(表達(dá)GFP)、GFP-C組(表達(dá)GFP、細(xì)胞因子干預(yù))、SUR組

11、(表達(dá)survivin)和SUR-C組(表達(dá)survivin、細(xì)胞因子干預(yù))。相同實驗條件重復(fù)4次。 4、凋亡檢測：Hoechst33342染色、TUNEL及流式細(xì)胞儀檢測亞二倍體峰。 5、survivin基因過表達(dá)對NIT-1細(xì)胞葡萄糖刺激的胰島素分泌功能的影響。 三、結(jié)果 1、重組pcDNA3.0-GFP-sur質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定雙酶切鑒定重組pcDNA3.0-GFP-sur質(zhì)粒，電泳示與理論值相符。測

12、序結(jié)果顯示插入片段與小鼠survivin基因cDNA序列(序列號：009689)一致，全長編碼區(qū)內(nèi)無核苷酸突變。 2、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染小鼠survivin基因NIT-1細(xì)胞的鑒定(1)實時熒光RT-PCR檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞survivin基因的表達(dá)，顯示SUR組survivinmRNA水平升高了5倍左右。 (2)Westernblot檢測NIT-1細(xì)胞survivin蛋白表達(dá)，結(jié)果示SUR組16.5kD處的特異蛋白條帶明顯增強，差

13、異有統(tǒng)計學(xué)意義。 3、凋亡檢測：Hoechst33342染色、TUNEL檢測及流式細(xì)胞儀檢測Hoechst33342染色、TUNEL及流式細(xì)胞儀檢測亞二倍體峰顯示比較一致的結(jié)果，轉(zhuǎn)染與細(xì)胞因子干預(yù)兩因素之間存在明顯的交互效應(yīng)(三種檢測方法均為P＜0.01)。細(xì)胞凋亡率在每大組內(nèi)細(xì)胞因子干預(yù)亞組高于非干預(yù)亞組，均為P＜0.01。在非細(xì)胞因子干預(yù)的各亞組之間細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P＞0.05)。細(xì)胞因子干預(yù)的各亞組中，SU

14、R-C組低于CC組(Hoechst33342染色示5.78±0.81％vs10.69±1.35％，P＜0.01；TUNEL檢測示6.31±0.77％vs16.76±3.02％，P＜0.01；亞二倍體峰9.67±2.36％vs16.56±0.9％，P＜0.01)，SUR-C組低于GFP-C組(Hoechst33342染色示5.78±0.81％vs10.64±1.33％，P＜0.01；TUNEL檢測示6.31±0.77％vs16.87±2.

15、24％，P＜0.01；亞二倍體峰9.67±2.36％vs17.27±3.53％，P＜0.01)。此外，SUR-C組高于C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。 4、過表達(dá)survivin對NIT-1細(xì)胞胰島素分泌功能的影響各組細(xì)胞胰島素分泌水平分別為：C組為2.74±0.35μg/g蛋白，CC組為1.08±0.17μg/g蛋白，GFP組為2.36±0.32μg/g蛋白，GFP-C組為0.96±0.13μg/g蛋白，SUR組為2.

16、47±0.32μg/g蛋白，SUR-C組為1.43±0.54μg/g蛋白。胰島素水平在每大組中細(xì)胞因子干預(yù)亞組低于非干預(yù)亞組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均小于0.01)。在非細(xì)胞因子干預(yù)的三個亞組中胰島素水平的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.391，P=0.298)。在細(xì)胞因子干預(yù)的三個亞組中，SUR-C組胰島素水平高于CC組和GFP-C組，但差異未達(dá)統(tǒng)計學(xué)意義(1.43±0.54vs1.08±0.17，P=0.157；1.43±0.54vs0.