雞毒支原體S6株P(guān)25、P33蛋白粘附特性的研究.pdf

1、雞毒支原體（MG）能夠引起雞慢性呼吸道疾病（CRD）與火雞傳染性竇炎，其感染給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。
　　雞毒支原體（MG）缺乏典型細胞壁結(jié)構(gòu)，主要通過表面粘附蛋白來粘附、侵染宿主細胞。粘附蛋白是雞毒支原體定植于宿主細胞表面的關(guān)鍵因子，其在MG致病過程中發(fā)揮著重要作用。并且粘附蛋白可作為潛在的診斷用抗原，其在雞毒支原體感染的診斷應(yīng)用過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。本研究依據(jù)生物信息學軟件對MG S6株基因組全部序列的分析，選取了

2、一個675bp的假定膜蛋白基因p25與915bp的假定粘附蛋白基因p33，重點研究它們可能具有的的粘附特性，為MG S6株診斷用抗原的篩選奠定基礎(chǔ)。
　　本研究通過定點突變分別獲得了可以體外表達的p25與p33基因，并利用原核表達系統(tǒng)分別獲得了可溶性表達的P25與P33重組蛋白即（rP25與rP33），然后用純化后的重組蛋白分別免疫兔子制備rP25與rP33抗血清。分別利用rP25與rP33抗血清對MG S6株及雞滑液囊支原體（M

3、S）進行鑒別，western blot實驗結(jié)果顯示，rP25與rP33抗血清能將二者鑒別開，因而推斷P25與P33可作為潛在的診斷用抗原。同時分別提取MG膜蛋白與漿蛋白組分，western blot實驗結(jié)果顯示P25與P33均在MG S6株的胞膜與胞漿中有分布。激光共聚焦掃描顯微鏡觀察顯示，rP25與rP33均能像MG S6一樣可以明顯粘附到雞胚成纖維細胞系（DF-1細胞）上。而夾心ELISA檢測結(jié)果則表明rP25及rP33對DF-1細

4、胞的粘附為特異性粘附，其中兔抗rP25與rP33血清可以明顯抑制MG S6對DF-1細胞的粘附作用。流式細胞儀與透射電鏡檢測結(jié)果也同樣顯示，兔抗rP25與rP33血清能夠明顯抑制MG S6對DF-1細胞的粘附，并且兔抗rP25與rP33血清聯(lián)合作用抑制MG S6對DF-1細胞的粘附效果也很顯著。從而證明P25與P33均是MG的粘附相關(guān)蛋白，并可作為潛在的診斷用抗原，為后續(xù)的應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。
　　為了研究P25與P33粘附到宿主細

5、胞上是否能引起相關(guān)的免疫反應(yīng)，本研究利用實時熒光定量PCR及ELISA實驗來檢測細胞因子IL-2、IL-4、IL-10、IL-1β以及IFN-γ的轉(zhuǎn)錄及表達釋放情況。結(jié)果均顯示rP25及rP33刺激DF-1細胞后相關(guān)細胞因子的轉(zhuǎn)錄及釋放量與對照相比均不同程度的升高，從而證明P25與P33可作為潛在的免疫保護性抗原。
　　綜上，證明了P25與P33為雞毒支原體S6株的粘附相關(guān)蛋白，并可作為潛在的診斷用抗原；同時也證明了P25與P33