中醫(yī)不同治法控制癲癇發(fā)作的實(shí)驗(yàn)性分子學(xué)機(jī)理研究.pdf

1、第一部分 癲癇實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⒓霸u(píng)價(jià) 目的：建立并確認(rèn)適于本研究并代表I臨床強(qiáng)直-陣攣、失神和復(fù)雜部分性發(fā)作的三種癲癇動(dòng)物模型。 方法：(1)分別包括：①昆明(KM)小鼠30只，經(jīng)電刺激誘導(dǎo)呈強(qiáng)直性驚厥表現(xiàn)的最大電休克模型(Maximalelectroshock，MES)；②KM小鼠30只，以戊四氮(Pentylenetetrazol，PTZ)85mg／kg皮下注射，誘導(dǎo)肌陣攣樣癲癇發(fā)作，建立戊四氮驚厥閾值性發(fā)作模

2、型(Metrazolseizurethreshold,MST)；③Wistar大鼠30只，氯化鋰160mg／kg腹腔注射，18h～24h后匹羅卡品40mg／kg腹腔注射，誘導(dǎo)產(chǎn)生SE(Statusepilepticus)，存活大鼠出現(xiàn)>RacineⅢ級(jí)自發(fā)性癲癇發(fā)作者為成功的鋰—匹羅卡品(Li-Piloca)模型。(2)確認(rèn)戊四氮模型初期肌陣攣發(fā)作皮層起源：記錄戊四氮模型動(dòng)物癲癇發(fā)作期腦電圖，證實(shí)是否伴有EEG癇樣發(fā)放。利用雙向穿梭箱(

3、Two-wayshuttlebox)，以主動(dòng)逃避反應(yīng)(Activeavoidanceresponse，AAR)、被動(dòng)逃避反應(yīng)(Passiveescaperesponse，PER)及逃逸失敗(Escapefailure)陽(yáng)性率為觀察指標(biāo)，判斷大鼠肌陣攣發(fā)作中意識(shí)狀況。 結(jié)論：(1)成功建立MES、MST和Li-Piloca癲癇模型，它們分別適于對(duì)強(qiáng)直-陣攣、失神和復(fù)雜部分性發(fā)作等三種不同類(lèi)型發(fā)作的藥理學(xué)、藥效學(xué)研究；(2)三

4、種模型造模簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好，可重復(fù)性強(qiáng)。為本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究不同治法控制癲癇發(fā)作的分子學(xué)機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)；(3)經(jīng)發(fā)作中EEG和行為學(xué)測(cè)試證實(shí)，即使缺乏明顯抽搐行為，PTZ模型的初期肌陣攣(Ⅰ級(jí))仍屬皮層起源，伴有短暫意識(shí)障礙。 第二部分 抗癲癇中藥篩選及其藥效學(xué)的實(shí)驗(yàn)性研究 目的：聯(lián)合前述三種癲癇模型，從公認(rèn)的八味抗癲癇中藥中篩選出主要具有豁痰、開(kāi)竅和祛風(fēng)作用的有效中藥。 方法：(1)分別以MES

5、、MST及Li—Piloca模型設(shè)立中藥組，西藥組和模型對(duì)照組及正常對(duì)照組，各自給予天麻、蜈蚣、全蝎、鉤藤、石菖蒲、天南星、蜂房、狼毒，以及由后三者組成的抗癇合劑，因不同模型和不同藥物共組成84小組(每組10只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物)。分組灌胃給藥，2次／天，連續(xù)28天。于末次給藥結(jié)束后60min誘導(dǎo)癲癇發(fā)作，觀察記錄發(fā)作潛伏期、發(fā)作級(jí)別及驚厥動(dòng)物數(shù)，對(duì)比各種中藥在控制三種模型癲癇發(fā)作中的療效；(2)相同方法重復(fù)驗(yàn)證所篩出的中藥對(duì)三種模型發(fā)作的效果。

6、 結(jié)論：(1)鉤藤、石菖蒲、天南星、蜂房和狼毒等5味單藥對(duì)MES和Li-piloca模型有顯著療效，使發(fā)作率減少50％～60％，并明顯延長(zhǎng)發(fā)作潛伏期；(2)在篩選和重復(fù)驗(yàn)證基礎(chǔ)上，選定天南星、石菖蒲和鉤藤三味單藥，深入探索中醫(yī)豁痰、開(kāi)竅和祛風(fēng)等三種治法，在控制不同類(lèi)型癲癇發(fā)作中腦內(nèi)神經(jīng)元分子生物學(xué)變化特征的研究；(3)被篩選的8味中藥及其合劑對(duì)代表臨床失神發(fā)作的MST模型療效均較差，需要進(jìn)一步篩選發(fā)掘更有效中藥或方劑。

7、 第三部分 不同模型癇性發(fā)作腦內(nèi)主要遞質(zhì)的變化特征 目的：探討不同模型癇性發(fā)作腦內(nèi)主要神經(jīng)遞質(zhì)GABA／Glu系統(tǒng)的變化特征。 方法：采用氨基酸分析儀、熒光標(biāo)記術(shù)、微量紫外比色法、免疫組化及原位雜交等技術(shù)，按發(fā)作后即刻、24h、48h、72h和1w等時(shí)點(diǎn)，動(dòng)態(tài)定量分析三種模型癇性發(fā)作后海馬GABA／Glu濃度、神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度、GABA—T活性、GAD67蛋白及GABAAR、NMDAR1和G

8、luR1的mRNA表達(dá)特點(diǎn)和變化規(guī)律。 結(jié)論：(1)MES模型癲癇發(fā)作的神經(jīng)遞質(zhì)及相關(guān)分子生物學(xué)機(jī)制包括：①神經(jīng)元抑制性遞質(zhì)相關(guān)功能顯著性降低：表現(xiàn)在GABA含量顯著低下，GAD活性受抑制，從而降低GABA含量。同時(shí)，促使GABA分解的GABA—T活性持續(xù)增高；②神經(jīng)元興奮性遞質(zhì)相關(guān)功能增高：表現(xiàn)在腦內(nèi)Glu含量顯著增高。Glu受體被同步激活，其中NMDA受體的激活較AMPA更突出。胞內(nèi)游離Ca2+濃度持續(xù)增高。(2)MST

9、模型腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的變化與MES相仿，發(fā)作中腦內(nèi)GABA含量呈同等程度減低，但Glu含量的增高僅及其它兩模型的一半。同時(shí)，GABA-T和GABAAR的活性增高以額葉更突出。(3)Li-Piloca模型較MES及MST模型有更特殊的腦內(nèi)遞質(zhì)異常改變，主要包括：①神經(jīng)元抑制性遞質(zhì)相關(guān)功能降低更為顯著：腦內(nèi)GABA含量持續(xù)而顯著地降低，降幅高于其它兩種模型。持續(xù)而極度增高的GABA-T活性可能是該模型腦內(nèi)GABA濃度持續(xù)降低，并導(dǎo)致癲癇慢性發(fā)作

10、的一個(gè)重要原因。與另兩種模型不同，Li-Piloca模型腦內(nèi)GABA-T或GABAAR活性，均以海馬區(qū)表達(dá)最為突出；②神經(jīng)元興奮性遞質(zhì)相關(guān)功能增高：包括腦內(nèi)Glu含量顯著增高和Glu受體被同步性激活，但NMDAR1表達(dá)的最大增幅僅為MES及MST的1／4～1／5。海馬區(qū)NMDAR1表達(dá)高于額區(qū)。各時(shí)點(diǎn)胞內(nèi)Ca2+濃度顯著高于額葉和其它兩種模型，提示海馬是該模型癇性活動(dòng)最活躍區(qū)域。 第四部分 中醫(yī)不同治法控制癲癇

11、發(fā)作分子機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究 目的：探討中醫(yī)不同治法控制不同類(lèi)型癲癇發(fā)作的分子作用機(jī)理。 方法：MES、MST及Li-Piloca模型，分別給予天南星、石菖蒲及鉤藤灌胃，2次／天，連續(xù)28天。末次給藥結(jié)束后，采用氨基酸分析儀、熒光標(biāo)記術(shù)、微量紫外比色法、免疫組化及原位雜交等技術(shù)，按發(fā)作后即刻、24h、48h、72h和1W等時(shí)點(diǎn)，動(dòng)態(tài)定量分析三種模型癇性發(fā)作后海馬GABA／Glu濃度、神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度、GABA—T活性

12、、GAD67蛋白及GABAAR、NMDAR1和GluR1的mRNA表達(dá)影響。與未治療組及正常對(duì)照組比較，揭示三種藥物對(duì)不同模型癲癇發(fā)作腦內(nèi)主要神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)GABA／Glu的影響。 結(jié)論：(1)三味藥物均能增加腦內(nèi)，尤其海馬GABA含量、而Glu含量降低，以MES和Li-Piloca模型發(fā)作中最突出。在MST模型，其影響幅度不及前兩者一半，維持時(shí)間短暫；(2)三藥對(duì)MST模型發(fā)作后腦內(nèi)遞質(zhì)系統(tǒng)其它機(jī)制缺少影響，導(dǎo)致它們對(duì)該模

13、型發(fā)作控制無(wú)效；(3)天南星明顯上調(diào)GAD67活性和GABAAR的表達(dá)，降低GABA-T活性。同時(shí)明顯下調(diào)GluR1和Li-Piloca模型發(fā)作中NMDARl表達(dá)，但對(duì)MES模型NMDAR1無(wú)效。此外，還顯著降低胞內(nèi)游離Ca2+濃度，尤以對(duì)Li-Piloca模型海馬區(qū)最明顯；(4)石菖蒲對(duì)Glu遞質(zhì)系統(tǒng)顯示更多影響，對(duì)Glu受體影響比天南星突出，除明顯降低Li-Piloca模型腦內(nèi)NMDAR1和GluR1(AMPA)外，特別對(duì)MES模型

14、的NMDAR1表達(dá)有明顯功效。同時(shí)，較天南星更早地降低兩模型胞內(nèi)Ca2+濃度，和更明顯下調(diào)Li-Piloca模型腦內(nèi)尤其海馬GABA-T活性，并增強(qiáng)GABAAR表達(dá)。然而，該藥對(duì)MES模型腦內(nèi)GABAAR、GAD67的表達(dá)，以及對(duì)GABA-T活性的降低均不及天南星；(5)鉤藤增加海馬GABA含量的幅度與天南星相近，顯著強(qiáng)于石菖蒲，持續(xù)時(shí)間較二者長(zhǎng)。顯著上調(diào)兩模型腦內(nèi)GABAAR受體表達(dá)，較另兩藥更突出抑制Li-Piloca模型腦內(nèi)異常增