川芎嗪抗小鼠實(shí)驗(yàn)性癲癇的研究.pdf

1、目的與意義:癲癇(EP)是神經(jīng)系統(tǒng)常見的慢性疾病，病程長且反復(fù)發(fā)作。流行病學(xué)表示，在世界范圍內(nèi)癲癇患者約占1％，而我國每年癲癇的發(fā)病率約23/10萬左右，估計(jì)現(xiàn)有癲癇病人約455萬～630萬人?，F(xiàn)階段臨床上對癲癇的治療仍以口服抗癲癇藥物為主。現(xiàn)代抗癲癇藥物(AEDS)都是人工合成的化學(xué)性藥物，目前可控制約80％患者的癲癇發(fā)作，但患者需要長期甚至終身服藥治療。然而化學(xué)合成藥物不可避免其毒副作用，多數(shù)AEDS會(huì)對神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及血液系統(tǒng)

2、產(chǎn)生不良影響，患者可能會(huì)出現(xiàn)頭暈、乏力、惡心、嘔吐以及血小板減少等一系列癥狀。再者，隨著服藥時(shí)間的增長，多數(shù)患者耐藥性不斷提高，只能加大藥物劑量或者更換新藥，這樣無形之中提高了治療成本，且副作用加大。因此不斷尋找新的抗癲癇藥物非常有必要，尤其是從中藥中開辟新的途徑。中藥防治癲癇具有緩效，作用時(shí)間長，副作用少，毒副反應(yīng)輕等特點(diǎn)。近年來中藥抗癲癇治療逐漸成為熱點(diǎn)，某些藥物已在臨床取得明顯療效。
　　 癲癇屬于中醫(yī)“癇癥”范疇，又名“

3、羊角風(fēng)”。因其發(fā)病與先天因素相關(guān)，故有“胎病”之稱。其病因病機(jī)，中醫(yī)認(rèn)為與先天因素、六淫疫毒、痰濁內(nèi)生、七情失調(diào)、腦竅外傷等有關(guān)。因先天因素或外邪致風(fēng)陽、痰濁、瘀血蒙蔽清竅，氣機(jī)逆亂，腦神失養(yǎng)導(dǎo)致癲癇發(fā)作。病位在腦，涉及肝、脾、腎三臟。中醫(yī)藥治療癲癇已有上千年歷史，且取得一定療效，現(xiàn)代醫(yī)家在繼承傳統(tǒng)方藥治法的基礎(chǔ)上不斷創(chuàng)新，進(jìn)一步豐富了癲癇的證治內(nèi)容。主要論治要法大體可分為“從肝論治”“從痰論治”“從脾論治”“從瘀論治”“從腎論治”等。

4、
　　 本課題組認(rèn)為肝臟功能的異常與癲癇的發(fā)作有著密不可分的關(guān)系。肝為風(fēng)木之臟，其氣升發(fā)，喜條達(dá)而惡抑郁，主筋，開竅于目。肝主疏泄而藏血，肝氣順暢，則諸臟腑、經(jīng)絡(luò)調(diào)和，氣血運(yùn)行正常;若肝氣郁滯，水津運(yùn)化失調(diào)，聚而生痰，痰濁隨氣上逆，痹阻經(jīng)絡(luò)，蒙蔽清竅則導(dǎo)致病人神昏或抽搐發(fā)作。此外，肝藏血，血屬陰，倘若陰血不足，則不能遏制陽旺，從而導(dǎo)致陽化風(fēng)動(dòng);肝血不足，不可養(yǎng)筋，則也會(huì)出現(xiàn)肢體抽搐。若肝旺以致升發(fā)太過，會(huì)生風(fēng)動(dòng)火，煎熬津液，既則

5、結(jié)而為痰，風(fēng)動(dòng)痰升，阻塞清竅，而出現(xiàn)昏仆抽搐。歷代醫(yī)家在古籍中都有以上觀點(diǎn)的陳述?！饵S帝內(nèi)經(jīng)素問·卷二十一》曰:“木發(fā)之郁，太虛埃昏，大風(fēng)乃至，屋發(fā)折木……甚則耳鳴眩轉(zhuǎn)，目不識(shí)人，善暴僵仆?！边@是一段描寫癲癇從肝論治的理論基礎(chǔ)?！度驑O一病癥方論》說:“夫癲癇病，皆由驚動(dòng)，使臟氣不平，郁而生涎，閉塞諸經(jīng)，撅而乃成。”也說明了癲癇的病因在于肝的疏泄失職。《內(nèi)經(jīng)·大奇論》曰:“肝脈小急，癇瘛痙攣?！薄度彘T事親·癇》曰:“大凡風(fēng)癇病發(fā)，項(xiàng)強(qiáng)直

6、視，不省人事，此乃肝經(jīng)有熱也?！薄端貑枴ぶ琳嬉笳摗吩?“諸風(fēng)掉眩，皆屬于肝?！惫手胃问侵委煱d癇疾病的關(guān)鍵所在。本課題組自擬中藥復(fù)方柴胡桂枝湯，以疏肝理氣，鎮(zhèn)肝潛陽之功效在臨床治療癲癇疾病取得顯著療效。
　　 川芎作為為傳統(tǒng)中藥，已廣泛應(yīng)用到神經(jīng)系統(tǒng)及心腦血管系統(tǒng)疾病的治療中，其提取物川芎嗪具有改善循環(huán)，擴(kuò)張血管，抗血小板聚集等多項(xiàng)作用，故在同類藥物的篩選中更具有優(yōu)勢。因不同的癲癇模型作用部位及作用機(jī)制不同，可用于探討抗癲癇藥物

7、的作用機(jī)制也不同。既往有關(guān)川芎嗪抗癲癇的研究僅僅建立某一種癲癇模型去證實(shí)川芎嗪的抗癲癇作用，不夠全面系統(tǒng)。本課題組參考國內(nèi)外成熟的癲癇模型研究，結(jié)合自身實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)，并通過預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索建模所需藥物劑量，學(xué)習(xí)模型動(dòng)物的飼養(yǎng)及護(hù)理方法，最后成功建立四種不同的癲癇模型，并從行為學(xué)方面系統(tǒng)評價(jià)了川芎嗪抗癲癇的作用。對既往的相關(guān)研究進(jìn)行了證實(shí)與補(bǔ)充。
　　 方法與內(nèi)容:
　　 1.最大電驚厥癲癇模型的建立
　　 1.1材料:實(shí)驗(yàn)

8、動(dòng)物選取昆明種小鼠，體重18～22g，雄性，由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。儀器采用YSD-4G藥理生理實(shí)驗(yàn)多用儀，由安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)。
　　 1.2方法:實(shí)驗(yàn)前24h作最大電驚厥的篩選，即用兩鱷魚夾分別夾住小鼠雙耳尖部，預(yù)實(shí)驗(yàn)確定定95％以上動(dòng)物強(qiáng)直性驚厥發(fā)作的參數(shù)為(100V;20Hz)以后肢強(qiáng)直性伸直為指標(biāo)，陽性者入選。
　　 選取符合驚厥標(biāo)準(zhǔn)的昆明小鼠60只，每組15只，分成4組。分別腹腔注射NS

9、、TMP200、400、800mg/kg，于給藥后1h、2h、3h、4h、5h分別測定最大電驚厥的小鼠只數(shù)。以探究川芎嗪抗癲癇作用的時(shí)量效關(guān)系。結(jié)果見圖3-1。
　　 再次選取符合驚厥標(biāo)準(zhǔn)的昆明小鼠50只，每組10只，分成5組。隨機(jī)分為模型組、川芎嗪高、中、低劑量組和安定組。按TMP200、400、800mg/kg劑量灌胃給藥，模型組給予等體積的生理鹽水，安定組用生理鹽水配成0.4mg/ml的溶液。給藥60min后，電刺激1次，

10、計(jì)算各組小鼠發(fā)生驚厥只數(shù)及驚厥發(fā)生率。結(jié)果見表3-1。
　　 2.戊四氮小鼠急性癲癇模型的建立
　　 2.1材料:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取昆明種小鼠，體重18～，22g，雄性，由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。戊四氮注射液購自Sigama公司，安定（地西泮注射液）由天津金耀氨基酸有限公司提供。
　　 2.2方法:預(yù)實(shí)驗(yàn)確定95％以上動(dòng)物出現(xiàn)陣攣性抽搐的戊四氮?jiǎng)┝?，用生理鹽水配成8.5mg/ml溶液。選取小鼠50只，每組10只，

11、隨機(jī)分為模型組、川芎嗪高劑量組、中劑量組、低劑量組和安定組。按TMP200、400、800mg/kg劑量灌胃給藥，模型組給予等體積的生理鹽水，安定組用生理鹽水配成0.4mg/ml的溶液。給藥60min后，腹腔注射相應(yīng)劑量的戊四氮注射液。觀察指標(biāo)采用Racine標(biāo)準(zhǔn)，0級:無反應(yīng);Ⅰ級:節(jié)律性口角、耳或面部肌肉抽動(dòng)陣攣;Ⅱ級:點(diǎn)頭并伴隨更嚴(yán)重的面部肌肉抽動(dòng)陣攣;Ⅲ級:出現(xiàn)前肢陣攣但不伴隨直立;Ⅳ級:前肢陣攣伴隨直立;Ⅴ級:全身強(qiáng)直陣攣發(fā)作

12、而跌倒。給藥后持續(xù)觀察30min，記錄小鼠陣發(fā)性痙攣發(fā)作的潛伏期（1-3級的發(fā)作時(shí)間），強(qiáng)直性驚厥（5級發(fā)作）的小鼠只數(shù)，大于30min小鼠死亡的只數(shù)，同時(shí)計(jì)算驚厥發(fā)作率和死亡保護(hù)率。結(jié)果見表3-2和圖3-2。
　　 3.士的寧小鼠急性癲癇模型的建立
　　 3.1材料:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取昆明種小鼠，體重18～22g，雄性，由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。士的寧注射液購自Sigama公司，安定（地西泮注射液）由天津金耀氨基酸有限

13、公司提供。
　　 3.2方法:預(yù)實(shí)驗(yàn)確定95％以上動(dòng)物出現(xiàn)陣攣性抽搐的士的寧劑量，用生理鹽水配成0.2mg/ml溶液。選取小鼠50只，每組10只，隨機(jī)分為模型組、川芎嗪高劑量組、中劑量組、低劑量組和安定組。按TMP200、400、800mg/kg劑量灌胃給藥，模型組給予等體積的生理鹽水，安定組用生理鹽水配成0.4mg/ml的溶液。給藥60min后，腹腔注射相應(yīng)劑量的士的寧注射液，持續(xù)觀察30min，觀察指標(biāo)同前。記錄小鼠陣發(fā)性痙

14、攣發(fā)作的潛伏期，強(qiáng)直性驚厥的小鼠只數(shù)，大于30min小鼠死亡的只數(shù)，同時(shí)計(jì)算驚厥發(fā)作率和死亡保護(hù)率。結(jié)果見表3-3和圖3-3。
　　 4.匹羅卡品小鼠急性癲癇模型的建立
　　 4.1材料:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取昆明種小鼠，體重18～22g，雄性，由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。匹羅卡品注射液購自Sigama公司，安定（地西泮注射液）由天津金耀氨基酸有限公司提供。
　　 4.2方法:預(yù)實(shí)驗(yàn)確定95％以上動(dòng)物出現(xiàn)陣攣性抽搐的匹

15、羅卡品劑量，用生理鹽水配成40mg/ml溶液。選取小鼠50只，每組10只，隨機(jī)分為模型組、川芎嗪高劑量組、中劑量組、低劑量組和安定組。按TMP200、400、800mg/kg劑量灌胃給藥，模型組給予等體積的生理鹽水，安定組用生理鹽水配成0.4mg/ml的溶液。給藥60min后，腹腔注射相應(yīng)劑量的匹羅卡品注射液，持續(xù)觀察30min，觀察指標(biāo)同前。記錄小鼠陣發(fā)性痙攣發(fā)作的潛伏期，強(qiáng)直性驚厥的小鼠只數(shù)，大于30min小鼠死亡的只數(shù)，同時(shí)計(jì)算驚

16、厥發(fā)作率和死亡保護(hù)率。結(jié)果見表3-4和圖3-4。
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用spss(1)3.0統(tǒng)計(jì)軟件對上述觀察結(jié)果進(jìn)行分析處理。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多樣本的均數(shù)的比較急兩樣本均數(shù)的比較用方差分析，計(jì)數(shù)資料及率的比較用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05均表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.TMP對最大電驚厥急性小鼠癲癇模型的結(jié)果
　　 1.1TMP抗驚厥作用的時(shí)量效關(guān)系:于腹腔注射川芎嗪后，0.25

17、h時(shí)，低劑量川芎嗪組有1只小鼠未出現(xiàn)驚厥發(fā)作，MES的驚厥抑制率為7％;中劑量川芎嗪組有3只小鼠未出現(xiàn)驚厥發(fā)作，MES的驚厥抑制率為20％;高劑量川芎嗪組有8只小鼠未出現(xiàn)驚厥發(fā)作，MES的驚厥抑制率為53％。1h時(shí)，低劑量川芎嗪組有2只小鼠未出現(xiàn)驚厥發(fā)作，MES的驚厥抑制率為13％;中劑量川芎嗪組有8只小鼠未出現(xiàn)驚厥發(fā)作，MES的驚厥抑制率為53％，高劑量川芎嗪組有11只小鼠未出現(xiàn)驚厥發(fā)作，MES的驚厥抑制率為73％。結(jié)果表明川芎嗪抗驚

18、厥作用于0.25h即開始起效，0.5～1h時(shí)達(dá)到峰值，4h時(shí)作用基本消失。具體見圖3-1。
　　 1.2 TMP對最大電驚厥急性小鼠癲癇模型的結(jié)果:在最大電驚厥實(shí)驗(yàn)中，模型組10只小鼠中有9只出現(xiàn)驚厥發(fā)作，驚厥率為90％，川芎嗪中劑量組10只小鼠中有8只出現(xiàn)驚厥發(fā)作，驚厥率為30％，川芎嗪高劑量組10只小鼠中僅有2只出現(xiàn)驚厥發(fā)作，驚厥率為20％。由此可見，中、高劑量川芎嗪組的驚厥率明顯低于模型組的驚厥率。說明川芎嗪可明顯降低最大

19、電驚厥小鼠驚厥率。
　　 2.TMP對戊四氮小鼠急性癲癇模型的結(jié)果
　　 2.1TMP對戊四氮小鼠癇性發(fā)作潛伏期的影響:與模型組相比較，中、高劑量川芎嗪組均能夠明顯延長小鼠陣發(fā)性痙攣發(fā)作的潛伏期，且三組之間的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明中、高劑量川芎嗪可以延長戊四氮誘發(fā)的小鼠癇性發(fā)作的潛伏期。具體見表3-2。
　　 2.2 TMP對戊四氮致癇小鼠強(qiáng)直性驚厥發(fā)生率的影響:模型組小鼠在戊四氮誘導(dǎo)下強(qiáng)直性驚厥的發(fā)生率為1

20、00％，中、高劑量川芎嗪組的強(qiáng)直性驚厥率分別為50％和20％，均低于模型組的強(qiáng)直性驚厥率，且三組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明中、高劑量川芎嗪均可以降低戊四氮所致的實(shí)驗(yàn)性癲癇小鼠強(qiáng)直性驚厥發(fā)生率，且存在一定量效關(guān)系。具體見圖3-2。
　　 2.3 TMP對戊四氮致癇小鼠死亡時(shí)間及死亡保護(hù)率的影響:模型組小鼠死亡時(shí)間大于30分鐘的小鼠只數(shù)為0，死亡保護(hù)率為0％，中劑量川芎嗪組小鼠死亡時(shí)間大于30分鐘的小鼠只數(shù)為5，死亡保護(hù)率為50

21、％，高劑量川芎嗪組小鼠死亡時(shí)間大于30分鐘的小鼠只數(shù)為6，死亡保護(hù)率為60％，中、高劑量川芎嗪組的死亡保護(hù)率均高于模型組，且三組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)說明中、高劑量川芎嗪均可以延長戊四氮所致癲癇小鼠的死亡時(shí)間。具體見圖3-2。
　　 3.TMP對的寧小鼠急性癲癇模型的結(jié)果
　　 3.1 TMP對士的寧小鼠癇性發(fā)作潛伏期的影響:與模型組相比較，中、高劑量川芎嗪組均能夠明顯延長小鼠陣發(fā)性痙攣發(fā)作的潛伏期，且

22、三組之間的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明中、高劑量川芎嗪可以延長士的寧誘發(fā)的小鼠癇性發(fā)作的潛伏期。具體見表3-3。
　　 3.2 TMP對戊四氮致癇小鼠強(qiáng)直性驚厥發(fā)生率的影響:模型組小鼠在士的寧誘導(dǎo)下強(qiáng)直性驚厥的發(fā)生率為100％，中、高劑量川芎嗪組的強(qiáng)直性驚厥率分別為50％和30％，均低于模型組的強(qiáng)直性驚厥率，且三組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明中、高劑量川芎嗪均可以降低士的寧所致的實(shí)驗(yàn)性癲癇小鼠強(qiáng)直性驚厥發(fā)生率，且存在一定量效關(guān)系

23、。具體見圖3-3。
　　 3.3 TMP對士的寧致癇小鼠死亡時(shí)間及死亡保護(hù)率的影響:模型組小鼠死亡時(shí)間大于30分鐘的小鼠只數(shù)為0，死亡保護(hù)率為0％，中劑量川芎嗪組小鼠死亡時(shí)間大于30分鐘的小鼠只數(shù)為5，死亡保護(hù)率為50％，高劑量川芎嗪組小鼠死亡時(shí)間大于30分鐘的小鼠只數(shù)為7，死亡保護(hù)率為70％，中、高劑量川芎嗪組的死亡保護(hù)率均高于模型組，且三組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)說明中、高劑量川芎嗪均可以延長士的寧所致癲癇小

24、鼠的死亡時(shí)間。具體見圖3-3。
　　 4.TMP對匹羅卡品小鼠急性癲癇模型的結(jié)果:與模型組相比較，高劑量川芎嗪組能夠明顯延長小鼠陣發(fā)性痙攣發(fā)作的潛伏期，與模型組相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義中劑量川芎嗪組小鼠死亡只數(shù)大于30分鐘的小鼠只數(shù)為2，死亡保護(hù)率為20％，高劑量組小鼠死亡時(shí)間大于30分鐘的小鼠只數(shù)為2，死亡保護(hù)率為20％，與模型組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明高劑量川芎嗪僅可以延長匹羅卡品誘發(fā)的小鼠癇性發(fā)作的潛伏期。
　　 結(jié)論