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文檔簡介
1、乳腺癌是女性主要的惡性腫瘤之一。自殺基因療法是基因治療的重要策略,它通過轉(zhuǎn)基因的方法將人類不具有的自殺基因?qū)肽[瘤細(xì)胞內(nèi),其表達(dá)產(chǎn)物可將無毒性的藥物前體轉(zhuǎn)化為有毒性的代謝產(chǎn)物,影響細(xì)胞的生物合成,導(dǎo)致細(xì)胞死亡。我們利用重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的含Tet-On調(diào)控元件的HSVtk/GCV自殺基因治療系統(tǒng)對(duì)人類乳腺癌細(xì)胞株MCF-7進(jìn)行殺傷性實(shí)驗(yàn),結(jié)合彗星實(shí)驗(yàn)與Western Blotting、RT-PCR等實(shí)驗(yàn)技術(shù)初步研究該系統(tǒng)對(duì)乳腺癌細(xì)胞的D
2、NA損傷影響及其作用的分子機(jī)理。
第一章 rAAV介導(dǎo)的含Tet-On調(diào)控元件的HSVtk/GCV自殺基因系統(tǒng)對(duì)乳腺癌細(xì)胞DNA的損傷影響
將pAAV/TRE/Tet-On/HSVtk、pHelper和pAAV-RC三質(zhì)粒通過磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染至病毒包裝細(xì)胞HEK293T,獲得了重組腺相關(guān)病毒rAAV/TRE/Tet-On/HSVtk。對(duì)濃縮純化后的rAAV,以斑點(diǎn)雜交的方法檢測(cè)并計(jì)算rAAV的物理滴度為2.0
3、×1011/ml。以rAAV/TRE/Tet-On/HSVtk、Dox和GCV處理乳腺癌細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)分為rAAV+Dox+GCV組、rAAV+Dox組、rAAV+GCV組、rAAV組及陰性對(duì)照組。彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)自殺基因治療系統(tǒng)對(duì)該細(xì)胞DNA損傷的影響,結(jié)果顯示,藥物處理細(xì)胞48h后,rAAV+Dox+GCV組的細(xì)胞相對(duì)其他各組,細(xì)胞有明顯的彗星拖尾現(xiàn)象。通過統(tǒng)計(jì)分析彗尾面積百分率和彗矩檢測(cè)HSVtk自殺基因系統(tǒng)處理細(xì)胞前后造成的DNA損傷程
4、度,結(jié)果發(fā)現(xiàn),rAAV+Dox+GCV組的細(xì)胞相對(duì)其他各組,其DNA遷移程度明顯增大(P<0.05),表明該系統(tǒng)干預(yù)乳腺癌細(xì)胞后,會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷水平的提高。
第二章 rAAV介導(dǎo)的含Tet-On調(diào)控元件的HSVtk/GCV自殺基因系統(tǒng)對(duì)乳腺癌細(xì)胞DNA損傷反應(yīng)的分子機(jī)制的初步研究
本課題組前期用基因芯片技術(shù)檢測(cè)了自殺基因治療系統(tǒng)HSVtk/GCV對(duì)乳腺癌細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)譜的影響,結(jié)果顯示,rAAV+Dox
5、+GCV組細(xì)胞與其他各組相比:246個(gè)上調(diào)基因,64個(gè)下調(diào)基因,與DNA復(fù)制、DNA損傷與修復(fù)相關(guān)的基因比較多,還包括很多鋅指結(jié)構(gòu)蛋白。結(jié)合此結(jié)果,選取DNA損傷反應(yīng)相關(guān)的活性基因進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)。RT-PCR驗(yàn)證了ATM、p53、p27、CyclinE與CDK2在rAAV+Dox+GCV處理組與各對(duì)照組細(xì)胞之間的表達(dá)水平,結(jié)果顯示ATM、p53與p27表達(dá)顯著上調(diào),而CyclinE與CDK2則沒有表達(dá)差異。利用Western Bl
6、otting研究自殺基因治療系統(tǒng)干預(yù)后細(xì)胞DNA損傷后相關(guān)蛋白ATM、p53、p27、CyclinE與CDK2的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與其他各組相比,rAAV+Dox+GCV處理組的ATM、p53及p27蛋白表達(dá)水平上調(diào),而CyclinE與CDK2的表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化。我們推測(cè),HSVtk/GCV自殺基因治療系統(tǒng)對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的DNA損傷作用可能是通過一種p53依賴性的信號(hào)通路上調(diào)p27的表達(dá),進(jìn)而導(dǎo)致CyclinE-CDK
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