TeT-On調控HSV1-tk基因治療系統(tǒng)致MCF-7細胞DNA損傷及調亡機制研究.pdf

1、乳腺癌是嚴重危害女性健康的一種疾病，已經逐漸成為當今社會一個嚴峻的衛(wèi)生問題。目前迫切需要開發(fā)新的有效的和毒性低的治療系統(tǒng)來降低乳腺癌死亡率。腫瘤的自殺基因治療具有良好應用前景。其中單純皰疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因聯合GCV的治療系統(tǒng)應用最為廣泛。
　　在前期研究中，成功利用Tet-On調控系統(tǒng)對單純皰疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因tk實施了精確調控。通過彗星實驗檢測到該治療系統(tǒng)處理乳腺癌細胞株MCF-748 h后有明顯的彗星拖尾現象。我們推測

2、該系統(tǒng)對MCF-7細胞的殺傷作用可能參與DNA損傷修復或阻止DNA合成等過程。為了進一步揭示Tet-On調控HSV1-tk治療乳腺癌的分子機制，我們擬運用RT-PCR及Western blotting技術檢測DNA損傷修復相關分子在mRNA、蛋白水平的表達變化;免疫熒光技術檢測BRCA1、γ-H2AX在細胞中的定位;用MTT及集落形成實驗檢測細胞體外增殖;流式細胞術檢測細胞早期凋亡;DAPI染色進行細胞核形態(tài)觀察。結果顯示:該系統(tǒng)干預M

3、CF-7后，H2AX在mRNA水平表達上調;γ-H2AX在蛋白水平表達上調;免疫熒光組織化學顯示γ-H2AX定位于細胞核、BRCA1主要位于細胞質;MTT和集落形成實驗顯示MCF-7細胞的體外增殖能力受到影響;與DNA損傷修復相關的多種分子ATM、P53、BRCA1、PARP1、PNK、R2、TK1、CHK2、RB、P21等表達量上調;Western blotting檢測到PARP1蛋白的剪切現象，預示凋亡的產生。進一步檢測凋亡現象:流