脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞在重型再生障礙性貧血中的實驗研究.pdf

1、背景與目的：間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)存在于成人體內(nèi)許多組織內(nèi),可以通過其貼壁能力分離出來。間充質(zhì)干細(xì)胞有很強(qiáng)的克隆形成和擴(kuò)增能力,并且具有向成骨,脂肪,軟骨,神經(jīng)和內(nèi)皮等多向分化潛能。MSCs已經(jīng)應(yīng)用于很多疾病的臨床治療,包括急性心梗,自身免疫,輔助骨髓移植,神經(jīng)系統(tǒng)損傷等。Friedenstein等于1976年最早利用骨髓貼壁細(xì)胞培養(yǎng)形成成纖維細(xì)胞和其它間質(zhì)細(xì)胞,Toksoz等認(rèn)為這種原始

2、細(xì)胞可形成骨髓和外膜間質(zhì)細(xì)胞,構(gòu)成造血的微環(huán)境,形成結(jié)締組織骨架并產(chǎn)生細(xì)胞因子、化學(xué)因子和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白來調(diào)節(jié)造血細(xì)胞的歸巢和增殖。體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)造血依賴于復(fù)雜而完整的骨髓造血微環(huán)境,主要通過骨髓內(nèi)細(xì)胞和細(xì)胞間的相互作用、基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的生長或抑制因子,以及細(xì)胞基質(zhì)與造血細(xì)胞間的相互作用來調(diào)節(jié)造血功能。骨髓MSCs能合成IL-6、IL-11、SCF、flt-3配體等多種正性造血細(xì)胞生長因子,具有維持長期培養(yǎng)起始細(xì)胞(LTC-IC)增殖的能力,

3、促進(jìn)CD34+細(xì)胞的分化,提示MSC具有支持造血和促進(jìn)造血恢復(fù)的作用。重型再生障礙性貧血(再障)是一種少見的因造血干細(xì)胞障礙導(dǎo)致外周血細(xì)胞和骨髓細(xì)胞減少的疾病。目前,造血干細(xì)胞移植已經(jīng)成為能夠根治重型再生障礙性貧血唯一有效的方法。但是,造血干細(xì)胞移植也面臨諸多難題,而且某些問題如造血干細(xì)胞移植后造血重建緩慢,已經(jīng)成為困擾從事干細(xì)胞臨床移植的研究人員所面臨的一尷尬問題。因此,以最經(jīng)濟(jì)有效的方法盡快解決這一難題,已經(jīng)成為當(dāng)務(wù)之急。有研究證明

4、,來源于小鼠骨髓的多能干細(xì)胞經(jīng)尾靜脈輸注入經(jīng)致死劑量照射的異種系小鼠后,可有效促進(jìn)其造血重建。在本研究中,通過體內(nèi)外實驗,初步探討了脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose tissue-derived mesenchymalstem cells,AMSCs)促進(jìn)及重建造血的特性,以便為在臨床運用患者或供者脂肪源多能干細(xì)胞聯(lián)合造血干細(xì)胞移植治療方案的實施提供理論基礎(chǔ)。
　　材料和方法：1、實驗動物及試劑BALB/c(H-2Kd)小鼠20

5、只,雄性,6~8周齡,C57BL/6(H-2Kb)小鼠70只,雌性,7~8周齡,均購于河南省實驗動物中心。實驗小鼠在潔凈環(huán)境中飼養(yǎng):DMEM、MCDB-201、F12、谷氨酰胺、胰島素、表皮生長因子;胎牛血清、馬血清;膠原酶;胰酶;抗體:H-2Kd、FITC標(biāo)記的熒光二抗。2、供體雄性BALB/c小鼠AMSCs的制備將20只6~8周齡的雄性BALB/c小鼠脫脊處死,取其腹部皮下脂肪組織,剪碎,用D-Hank’s液洗去血細(xì)胞,2g/LⅡ型

6、膠原酶消化2h,洗掉膠原酶,離心收集細(xì)胞,細(xì)胞以2×106/ml的密度接種于含58％DMEM/F12+40%MCDB-201、2%胎牛血清(FCS)、10ng/mlEGF、1×胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸(Iusulin-Transferrin-Selenium,ITS)、1×亞油酸-牛血清白蛋白(linoleic acid-bovine serum albumin,LA-BSA)的培養(yǎng)液中,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),2d后換液,棄去未

7、貼壁的細(xì)胞,以后每3天半量換液。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70%~80%融合時,0.25%胰酶常規(guī)消化,細(xì)胞按照1:3傳代。3、供體雄性BALB/c小鼠AMSCs的鑒定光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),利用流式細(xì)胞術(shù)測定所培養(yǎng)細(xì)胞的免疫表型,用成骨、成脂肪誘導(dǎo)體系誘導(dǎo)細(xì)胞后,用Von Kossa染色檢測鈣化基質(zhì)沉淀,用油紅O染色檢測細(xì)胞內(nèi)脂肪滴的存在。4、供體小鼠骨髓細(xì)胞的制備將25只7~8周齡的雌性C57BL/6小鼠脫脊處死,無菌取其后肢的脛骨和股骨,以預(yù)冷的D-

8、Hank’s液沖出骨髓細(xì)胞,經(jīng)反復(fù)吹打分散細(xì)胞后,使之成單細(xì)胞懸液,以EDTA-NH4Cl液去除紅細(xì)胞,再以D-Hank’s液洗滌2次。2g/L臺盼蘭染色按常規(guī)方法計算活細(xì)胞率。5、小鼠重型再生障礙性貧血(再障)模型采用60Co-γ+氯霉素(CH)+環(huán)磷酰胺(CY)的方法。具體方法:雌性C57BL/6(H-2Kb)小鼠45只一次全身3.0Gy60Co-γ(劑量率1.3531Gy/min,距離170cm,射時間2min13s)照射后第4d

9、、5d、6d時ipCY50.0mg.kg-1及CH62.5 mg.kg-1。第8天實驗小鼠即表現(xiàn)出典型再障的特點。6、體內(nèi)移植將雌性C57BL/6(H-2Kb)再障小鼠隨機(jī)分為3組,每組15只,照射后第10d從尾靜脈輸入細(xì)胞:①對照組,輸入生理鹽水,0.2ml/只;②輸入雌性C57BL/6(H-2Kb)小鼠骨髓有核細(xì)胞(2×107/只)+雄性BALB/c小鼠AMSCs(3×106/只);③輸入雌性C57BL/6(H-2Kb)小鼠骨髓有核

10、細(xì)胞(2×107/只)。精心喂養(yǎng),觀察各組小鼠的存活情況。小鼠在輸注前查尾靜脈血常規(guī),計數(shù)有核細(xì)胞總數(shù);輸細(xì)胞后每周查血常規(guī),指標(biāo)同前。輸注2周后各組分別取小鼠一側(cè)股骨沖出骨髓,計數(shù)一條股骨有核細(xì)胞數(shù),測定CFU-GM。7、流式細(xì)胞儀測定H-2Kd制備移植小鼠的脾臟和骨髓單個核細(xì)胞懸液,溶紅細(xì)胞后進(jìn)行抗體染色:取適量上述細(xì)胞,加入生物素化H-2Kd單抗孵育過夜,用含有0.01%疊氮鈉和1%BSA的PBS洗兩遍,加入適當(dāng)稀釋后的異硫氰酸熒

11、光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)—鏈霉親和素,以PE-大鼠IgG同型對照為對照,4℃孵育45min,用上述洗液洗2次,流式細(xì)胞儀檢測。8、Y染色體PCR試驗實驗及對照組小鼠Y染色體SRY基因的引物序列如下:P1:5’-CTGCTGTGAACAGACACTAC-3’:P2:5’-GACTCCTCTGACTTCACTTG-3’。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性3min,然后94℃變性30s,61℃退火50

12、s,72℃延伸40s,共進(jìn)行28個循環(huán),72℃再延伸8min。9、統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS軟件,兩樣本均數(shù)間比較采用t檢驗,以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：1、BALB/c(H-2Kd)小鼠AMSCs的免疫表型:流式細(xì)胞儀檢測AMSCs細(xì)胞CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD105、Flk1及HLA-DR的表達(dá),結(jié)果顯示:CD29、CD44、CD105和Flk-1為陽性,CD31、CD34和HLA-DR為

13、陰性。2、多項分化檢測:成脂肪分化:AMSCs向脂肪細(xì)胞定向誘導(dǎo)14天后,未加脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基的對照組細(xì)胞油紅-O染色陰性,加入脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基的試驗組細(xì)胞可見油紅-O染色強(qiáng)陽性。成骨分化:AMSCs向成骨細(xì)胞定向誘導(dǎo)14天后,未加成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基的對照組細(xì)胞Von Kossa染色未見黑色礦化物沉積,而試驗組則見細(xì)胞間布滿黑色顆粒,顆粒大小不均一,提示有礦化物質(zhì)沉積。3、體內(nèi)促進(jìn)造血重建實驗:從輸注后第2周,聯(lián)合輸注AMSCs組小鼠外周血有核

14、細(xì)胞、骨髓有核細(xì)胞數(shù)都明顯高于單獨輸注小鼠骨髓有核細(xì)胞組小鼠(P<0.05),小鼠存活好;至輸注后第3周,對照組小鼠大部分死于造血衰竭,治療組也有少數(shù)小鼠死亡。但是治療組無論外周血還是骨髓中的有核細(xì)胞都較第2周明顯恢復(fù);聯(lián)合輸注AMSCs組小鼠,其骨髓CFU-GM值于第2周明顯高于單獨輸注小鼠骨髓有核細(xì)胞組小鼠(P<0.05);而單獨輸注生理鹽水組小鼠,在第三周僅剩一只存活。聯(lián)合輸注AMSCs組小鼠通過PCR方法特異性地擴(kuò)增SRY基因片