釉基質(zhì)蛋白對(duì)正常大鼠與糖尿病大鼠顱骨缺損愈合影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:研究證實(shí)釉基質(zhì)蛋白(Enamel matrix proteins,EMPs)可以促進(jìn)牙周組織包括牙槽骨的再生。本研究的目的是:
　　 1.提取并分析確定乙酸法提取的EMPs是釉原蛋白占優(yōu)勢(shì)的釉基質(zhì)蛋白,便于下一步的研究;
　　 2.探討EMPs作為生長(zhǎng)因子對(duì)正常大鼠極量顱骨缺損愈合的影響;
　　 3.探討EMPs作為生長(zhǎng)因子對(duì)糖尿病大鼠極量顱骨缺損愈合的影響。
　　 方法:
　　 1.采用乙

2、酸法提取豬發(fā)育期牙胚中EMPs,并進(jìn)行SDS-PGAE電泳分析。
　　 2.選用20只健康雄性Wistar大鼠,隨機(jī)分為兩組,每組10只(第一組左側(cè)顱骨為實(shí)驗(yàn)側(cè),右側(cè)為對(duì)照側(cè);第二組右側(cè)顱骨為實(shí)驗(yàn)側(cè),左側(cè)為對(duì)照側(cè))。水合氯醛腹腔注射麻醉后,于顱頂手術(shù)區(qū)備皮消毒。在前額做一長(zhǎng)約5-6cm的“U”形切口,切開(kāi)皮膚至顱骨表面,向后翻起“U”形皮瓣,充分暴露手術(shù)區(qū)。在不損傷硬腦膜的情況下,用球鉆在顱骨中線兩側(cè)各做一直徑5mm的圓形標(biāo)準(zhǔn)極

3、量骨缺損。按對(duì)照側(cè)和實(shí)驗(yàn)側(cè)分別植入植入物:對(duì)照側(cè)100mg/ml PGA(EMPs載體),實(shí)驗(yàn)側(cè)10mg/ml EMPs+100mg/ml PGA,嚴(yán)密縫合皮膚。術(shù)后青霉素鈉連續(xù)注射三天,預(yù)防感染。觀察并記錄實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的術(shù)后反應(yīng)及生長(zhǎng)情況,分別于第4周、第8周過(guò)量麻醉法處死大鼠,并進(jìn)行影像學(xué)檢查和組織切片觀察分析。
　　 3.選用25只健康雄性Wistar大鼠,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。過(guò)夜禁食后,按60mg/kg的STZ腹腔注射誘導(dǎo)糖尿病

4、大鼠模型。1周后測(cè)血糖,血糖≥16.7mmol/L者建模成功。誘導(dǎo)中1只大鼠死亡,其余24只隨機(jī)分為兩組,每組12只(第一組左側(cè)顱骨為實(shí)驗(yàn)側(cè),右側(cè)為對(duì)照側(cè);第二組右側(cè)顱骨為實(shí)驗(yàn)側(cè),左側(cè)為對(duì)照側(cè))。隨后的顱骨缺損手術(shù)、植入物的植入及標(biāo)本的處理等過(guò)程同2,但處死前需測(cè)血糖值,血糖≥16.7mmol/L納入統(tǒng)計(jì)。
　　 結(jié)果:
　　 1.EMPs分析顯示:大部分蛋白質(zhì)分子量條帶位于25KDa以下,優(yōu)勢(shì)條帶為20KDa、13KD

5、a和分子量更小的區(qū)間,其中20KDa的條帶含量最高。
　　 2.正常大鼠切口愈合良好,無(wú)炎癥,無(wú)感染,無(wú)排異反應(yīng)。X線片示:術(shù)后4周實(shí)驗(yàn)側(cè)與對(duì)照側(cè)的極量顱骨缺損范圍均無(wú)明顯縮小,但實(shí)驗(yàn)側(cè)缺損邊界出現(xiàn)模糊現(xiàn)象;術(shù)后8周實(shí)驗(yàn)側(cè)與對(duì)照側(cè)的極量顱骨缺損范圍均縮小,實(shí)驗(yàn)側(cè)較對(duì)照側(cè)縮小的更加明顯,缺損大部分被修復(fù)。相對(duì)骨密度分析均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差分別為:4周時(shí),實(shí)驗(yàn)側(cè)31.8±2.9,對(duì)照側(cè)25.8±2.85,兩者間具有顯著性差異(p<0.05)

6、:8周時(shí),實(shí)驗(yàn)側(cè)39.4±3.3,對(duì)照側(cè)28.6±3.2,兩者間具有顯著性差異(p<0.05)。組織學(xué)觀察顯示:4周時(shí),對(duì)照側(cè)疏松纖維結(jié)締組織大量存在,炎癥細(xì)胞廣泛浸潤(rùn),少量成骨細(xì)胞存在;實(shí)驗(yàn)側(cè)存在大量致密纖維結(jié)締組織,其內(nèi)部可見(jiàn)大量成條索狀、網(wǎng)狀和團(tuán)塊狀分布的嗜酸性骨基質(zhì)沉積,部分區(qū)域出現(xiàn)纖維樣骨結(jié)構(gòu);成骨細(xì)胞分布廣泛,缺損區(qū)邊界可見(jiàn)部分新骨生成,成骨跡象明顯。8周時(shí),對(duì)照側(cè)存在大量疏松的纖維結(jié)締組織,炎癥細(xì)胞仍廣泛存在,缺損區(qū)邊界有

7、部分纖維骨樣組織生成,其內(nèi)有一定量的成骨細(xì)胞存在。實(shí)驗(yàn)側(cè)有大量骨質(zhì)形成,部分成網(wǎng)織狀,部分成板層狀,局部區(qū)域形成哈佛氏系統(tǒng)和骨髓樣組織結(jié)構(gòu)。
　　 3.糖尿病大鼠偶有精神不振,出現(xiàn)多食、多飲、多尿癥狀,個(gè)別感染死亡。X線片示:術(shù)后4周和8周,實(shí)驗(yàn)側(cè)與對(duì)照側(cè)的極量顱骨缺損范圍均無(wú)明顯的縮小,缺損中心及周邊均無(wú)明顯的高密度影像。相對(duì)骨密度分析均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差分別為:4周時(shí),實(shí)驗(yàn)側(cè)31.8±6.8,對(duì)照側(cè)29.8±6.0,兩者間無(wú)顯著性差

8、異(p>0.05);8周時(shí),實(shí)驗(yàn)側(cè)34.6±4.6,對(duì)照側(cè)31.7±2.6,兩者間無(wú)顯著性差異(p>0.05)。組織學(xué)觀察顯示:術(shù)后4周和8周,對(duì)照側(cè)和實(shí)驗(yàn)側(cè)均被薄層纖維結(jié)締組織充填,缺損區(qū)邊界及纖維組織內(nèi)少見(jiàn)成骨細(xì)胞,無(wú)新骨形成,亦無(wú)明顯成骨跡象。
　　 結(jié)論:
　　 1.采用乙酸法從豬的牙胚中提取的釉基質(zhì)蛋白是典型的釉原蛋白占優(yōu)勢(shì)的EMPs表現(xiàn)。
　　 2.10mg/ml的EMPs與其載體PGA聯(lián)合應(yīng)用可以促