結(jié)核分枝桿菌dTDP-4-酮基-6-脫氧-L-鼠李糖還原酶（RmlD）的表達(dá)及酶活性測(cè)定.pdf

1、肺結(jié)核曾經(jīng)令人談虎色變，其病原菌就是結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)?，F(xiàn)在雖然有卡介苗預(yù)防接種，有藥物進(jìn)行治療，但由于耐藥菌株不斷出現(xiàn)，肺結(jié)核病卷土重來(lái)并非聳人聽(tīng)聞。因此，繼續(xù)研究結(jié)核分枝桿菌的生物學(xué)特性以開(kāi)發(fā)新藥，對(duì)預(yù)防和治療這種頑癥很必要。 細(xì)胞壁是分枝桿菌賴以生存的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。分枝菌酸、聚阿拉伯糖半乳糖及肽聚糖組成了其核心結(jié)構(gòu)。其中銜接雙糖(L-鼠李糖-D-N-乙酰葡萄糖胺)作為重要結(jié)構(gòu)把聚

2、半乳糖共價(jià)連接到肽聚糖大分子上。由于人體內(nèi)不存在鼠李糖分子，所以銜接雙糖中尤其是鼠李糖可作為抗結(jié)核藥物研發(fā)的理想靶標(biāo)。dTDP-L-鼠李糖是鼠李糖殘基的唯一供體。結(jié)核分枝桿菌基因組中rmlA-D四種基因編碼了RmlA-D四種酶，參與了由底物1-磷酸葡萄糖合成dTDP-L-鼠李糖的過(guò)程。所以RmlA-D四種酶的任一種酶都可作為開(kāi)發(fā)抗結(jié)核新藥的靶標(biāo)。 結(jié)核分枝桿菌dTDP-4-酮基-6-脫氧-L-鼠李糖還原酶即RmlD是dTDP-L

3、-鼠李糖合成途徑中的第四種酶。本論文通過(guò)建立分子伴侶和蛋白質(zhì)共表達(dá)RmlD體系同時(shí)改變誘導(dǎo)溫度而優(yōu)化rmlD基因在BL21(DE3)大腸桿菌中的高表達(dá)，以獲得大量的可溶性RmlD蛋白質(zhì)。用Ni-NTA親和層析純化RmlD蛋白質(zhì)，然后測(cè)定RmlD蛋白質(zhì)的酶活性。為進(jìn)一步完善RmlD酶活性測(cè)定方法，研究純RmlD酶的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特性和建立篩選RmlD酶抑制劑方法提供物質(zhì)基礎(chǔ)。 本論文獲得以下結(jié)果：1.RmlD蛋白質(zhì)在大腸桿菌BL2

4、1(DE3)中的表達(dá)將本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的pET16b-TbrmlD表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。用0.4mM的IPTG濃度在室溫22℃條件下和1mM的IPTG濃度在37℃下誘導(dǎo)rmlD基因的表達(dá)。用超聲方法破碎誘導(dǎo)的BL21(DE3)/pET16b-TbrmlD細(xì)菌，對(duì)上清和沉淀組分進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果表明RmlD蛋白質(zhì)在BL21(DE3)中得以表達(dá)，但以包涵體形式存在。 2.RmlD蛋白質(zhì)與分子伴侶共

5、表達(dá)體系的建立及RmlD的優(yōu)化表達(dá)將攜帶分子伴侶的pKJE7質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，獲得BL21(DE3)/pKJE7細(xì)菌。再將pET16b-TbrmlD質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)/pKJE7感受態(tài)細(xì)胞中(兩步法)。分別在室溫22℃和30℃條件下誘導(dǎo)分子伴侶和RmlD蛋白質(zhì)的共表達(dá)。用超聲方法破碎BL21(DE3)/pKJE7/pET16b-Tb-rmlD細(xì)菌，用SDS-PAGE電泳分析上清及沉淀組分中的表達(dá)產(chǎn)物，結(jié)

6、果表明在室溫22℃誘導(dǎo)溫度下RmlD蛋白質(zhì)主要以可溶性形式存在。 3.用Westernblot方法對(duì)RmlD蛋白質(zhì)的鑒定將SDS-PAGE凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用抗多聚組氨酸的單克隆抗體及偶聯(lián)堿性磷酸酶的馬抗小鼠IgG二抗進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，所表達(dá)的RmlD蛋白質(zhì)為rmlD基因產(chǎn)物。 4.RmlD酶蛋白活性的測(cè)定由于目前沒(méi)有商業(yè)化的RmlD酶的底物，所無(wú)法直接測(cè)定RmlD酶活性。以dTDP-葡萄糖(dTDP

7、-glucose)為底物，RmlB酶將底物dTDP-glucose轉(zhuǎn)變?yōu)镽mlC酶的底物，RmlC酶進(jìn)一步將RmlC酶的底物轉(zhuǎn)變?yōu)镽mlC酶的產(chǎn)物，RmlD酶最終將RmlC酶的產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)榻K產(chǎn)物TDP-鼠李糖(dTDP-rhamnose)，同時(shí)將反應(yīng)體系中的NADPH轉(zhuǎn)變?yōu)镹ADP+。通過(guò)測(cè)定NADPH在340nm處的光吸收的減少來(lái)確定RmlD的酶活性。 結(jié)論：結(jié)核桿菌RmlD在dTDP-鼠李糖的生物合成過(guò)程中起著重要作用，因此，