不同濃度膽紅素對(duì)新生兒臍血單核細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和分泌IL-6、TNF-α水平的影響.pdf

1、目的： 探討膽紅素對(duì)臍血單核細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及其分泌IL-6、TNF-α的影響。 方法： 1.分離鑒定單核細(xì)胞。選擇10例正常足月新生兒為研究對(duì)象，收集臍血，用淋巴細(xì)胞分離液分離臍血得到臍血單個(gè)核細(xì)胞（cord blood mononuclear cell ,CB-MNC）。采用明膠/自體血漿貼壁法獲得單核細(xì)胞：⑴明膠包被培養(yǎng)瓶；⑵用自體血漿包被明膠包被的培養(yǎng)瓶；⑶把單個(gè)核細(xì)胞接種于用明膠和自體血漿包被過的培養(yǎng)瓶中孵

2、育40～60min，倒出并洗掉未貼壁的細(xì)胞；⑷用5mMEDTA消化細(xì)胞，得到臍血單核細(xì)胞（cord blood monocyte,CBMC）。流式細(xì)胞儀檢測(cè)其純度，臺(tái)盼蘭測(cè)其活力。 2.膽紅素孵育單核細(xì)胞、鏡下觀察細(xì)胞。把單核細(xì)胞分別接種于含有不同濃度膽紅素（0mg/dl，6mg/dl，9mg/dl，12.9mg/dl，18mg/dl）的牛血清白蛋白（BSA/PBS）溶液中孵育1h。普通顯微鏡和熒光顯微鏡下觀察單核細(xì)胞形態(tài)及顏色

3、的改變；電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。 3.LPS刺激培養(yǎng)單核細(xì)胞。把膽紅素孵育后的CBMC分組：空白對(duì)照組（A組）、LPS對(duì)照組（B組）、6mg/dl膽紅素組（C組）、6mg/dl膽紅素+LPS組（D1組）、9mg/dl膽紅素+LPS組（D2組）、12.9mg/dl膽紅素+LPS組（D3組）和18mg/dl膽紅素+LPS組（D4組），吸出孵育液，加入完全培養(yǎng)基和LPS（1μg/ml）刺激培養(yǎng)24h。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA

4、）檢測(cè)培養(yǎng)上清液中IL-6及TNF-a的水平。 結(jié)果： 1.分離細(xì)胞后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD14陽性細(xì)胞率為（93.99±2.48）％，0.4％臺(tái)盼蘭檢測(cè)細(xì)胞活性為（92.61±2.39）％。 2.普通光鏡下，空白對(duì)照組（0mg/dl膽紅素組）：細(xì)胞呈圓形或橢圓形，貼壁生長(zhǎng)，生長(zhǎng)狀態(tài)好，大小均一；6mg/dl膽紅素組：可以觀察到3種細(xì)胞：顏色和形態(tài)正常的細(xì)胞、桔黃色形態(tài)正常的細(xì)胞、桔黃色鋸齒狀的細(xì)胞，以桔黃色但形態(tài)

5、正常的細(xì)胞占多數(shù)。9mg/dl膽紅素組：偶見顏色和形態(tài)正常的細(xì)胞，桔黃色鋸齒狀的細(xì)胞增多，仍是桔黃色形態(tài)正常的細(xì)胞占多數(shù)。12.9mg/dl和18mg/dl膽紅素組：未見形態(tài)正常的透亮的細(xì)胞，桔黃色鋸齒狀的細(xì)胞明顯增多，可看到鋸齒狀的細(xì)胞聚集成團(tuán)。隨著膽紅素濃度的升高，顏色和形態(tài)正常的細(xì)胞越來越少，桔黃色鋸齒狀的細(xì)胞越來越多；且桔黃色鋸齒狀的細(xì)胞顏色明顯深，胞體明顯增大。 3.熒光顯微鏡觀察細(xì)胞，在熒光下進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的膽紅素發(fā)紅色

6、熒光，膽紅素的量越多紅色熒光越強(qiáng)?？瞻讓?duì)照組（0mg/dl膽紅素組）：未見細(xì)胞。6mg/dl膽紅素組：對(duì)上述三種細(xì)胞進(jìn)行對(duì)照觀察，正常的細(xì)胞呈淡綠色，部分不可見；桔黃色但形態(tài)正常的細(xì)胞部分全是紅色，部分周邊呈紅色中間呈淡綠色；桔黃色鋸齒狀的細(xì)胞在熒光下齒突不明顯，全是紅色，熒光比無鋸齒的細(xì)胞強(qiáng)。9mg/dl膽紅素組：偶見淡綠色的細(xì)胞，紅色的細(xì)胞增多，周邊呈紅色中間呈淡綠色的細(xì)胞與6mg/dl膽紅素組相比紅色明顯占優(yōu)勢(shì)。12.9mg/dl

7、和18mg/dl下，全是紅色的細(xì)胞。 4.電鏡下觀察膽紅素孵育60min后的單核細(xì)胞，對(duì)照組：?jiǎn)魏思?xì)胞大小基本一致, 橢圓形, 細(xì)胞膜完整，細(xì)胞表面微絨毛似指狀突起。胞漿均勻一質(zhì)，胞漿內(nèi)細(xì)胞器豐富，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體、溶酶體、核糖體等清晰可見。細(xì)胞核呈腎形或馬蹄形，核膜清晰，完整，核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻。膽紅素組，隨著濃度的升高，可見細(xì)胞外形的改變，微絨毛消失，細(xì)胞膜破壞；胞漿內(nèi)線粒體腫脹,核糖體部分缺失，出現(xiàn)大小不等的空

8、泡，其余的細(xì)胞器不能辨認(rèn)；細(xì)胞核出現(xiàn)染色質(zhì)邊集、核濃縮、核碎裂、核溶解。 5.CBMC體外經(jīng)不同濃度膽紅素作用后經(jīng)LPS刺激分泌IL-6、TNF-α水平：⑴當(dāng)膽紅素濃度為6mg/dl時(shí)，LPS對(duì)CBMC分泌IL-6有促進(jìn)作用（P＜0.01），膽紅素對(duì)CBMC分泌IL-6有抑制作用（P＜0.01），膽紅素的抑制作用大于LPS的促進(jìn)作用。膽紅素對(duì)LPS刺激CBMC分泌IL-6有抑制作用，隨著濃度的升高這種抑制作用越明顯。當(dāng)膽紅素濃度

9、為6mg/dl時(shí)CBMC經(jīng)過膽紅素孵育，再接受LPS的刺激，分泌IL-6的水平無明顯變化（P＞0.05）。⑵當(dāng)膽紅素濃度為6mg/dl時(shí)，LPS對(duì)CBMC分泌TNF-α有促進(jìn)作用（P＜0.01），膽紅素對(duì)CBMC分泌TNF-α有抑制作用（P＜0.01），膽紅素的抑制作用大于LPS的促進(jìn)作用。膽紅素對(duì)LPS刺激CBMC分泌TNF-α有抑制作用，隨著濃度的升高這種抑制作用越明顯。當(dāng)膽紅素濃度為6mg/dl時(shí)CBMC經(jīng)過膽紅素孵育，再接受LP

10、S的刺激，分泌TNF-α的水平無明顯變化（P＞0.05）。⑶ CBMC分泌IL-6，TNF-α水平相關(guān)性分析結(jié)果顯示，IL-6和TNF-α水平呈正相關(guān)（r= 0.931 ，p<0.001）。即在相同膽紅素濃度作用下，單核細(xì)胞分泌IL-6的水平隨TNF-α的含量而變化。 結(jié)論： 本研究顯示，膽紅素可以使單核細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變，變?yōu)殇忼X狀；使細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器腫脹，形成空泡，進(jìn)一步引起核濃縮、核碎裂、核溶解等細(xì)胞壞死的改變；可以抑制