不同濃度抗磷脂抗體及TNF-α對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞分泌e-選擇素、IL-6、IL-8、MCP-1的影響.pdf

1、抗磷脂綜合征(APS)是一種系統(tǒng)性自身免疫性疾病，血清抗磷脂抗體(aPL)陽(yáng)性和血栓前狀態(tài)為APS的兩大重要血清學(xué)特征，這種血清學(xué)特征與栓塞的發(fā)生和病理妊娠密切相關(guān)。APS發(fā)病機(jī)制不明，血栓形成一直以來(lái)被認(rèn)為是APS發(fā)病的重要因素，而內(nèi)皮細(xì)胞活化則是血栓形成的重要原因?？贵w濃度及感染與APS的發(fā)病及預(yù)后關(guān)系密切，國(guó)內(nèi)外學(xué)者普遍認(rèn)為中高濃度情況下，濃度越高、病情越重、預(yù)后越差，感染則可加重APS病情。導(dǎo)致此種現(xiàn)象的機(jī)制未明，內(nèi)皮細(xì)胞是否參

2、與其中，國(guó)內(nèi)未見(jiàn)此方面研究。
　　aPL活化內(nèi)皮細(xì)胞具有特定的信號(hào)傳導(dǎo)通路，并非簡(jiǎn)單的磷脂結(jié)合途徑。大部分aPL直接與β2糖蛋白(I)(β2GPI)結(jié)合，aPL/β2GPI復(fù)合物進(jìn)一步結(jié)合于細(xì)胞表面。目前細(xì)胞的Toll樣受體(TLR)信號(hào)傳導(dǎo)通路尤其是TLR2和TLR4信號(hào)通路是研究的熱點(diǎn)，國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)TLR2參與aPL活化內(nèi)皮細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)中，而TLR4是否參與其中存在爭(zhēng)議，國(guó)內(nèi)未見(jiàn)相關(guān)研究。
　　內(nèi)皮細(xì)胞活化后可分泌多種

3、細(xì)胞因子，本文選擇E-選擇素(SELE)、單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)、白細(xì)胞介素6（IL-6）和白細(xì)胞介素8(IL-8)四種常用且敏感的指標(biāo)用以監(jiān)測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞活化后的分泌功能，其中E-選擇素mRNA表達(dá)量增加或降低時(shí)，其蛋白的表達(dá)水平發(fā)生相應(yīng)的上調(diào)或下調(diào)，因此本文分別從mRNA及蛋白水平對(duì)E-選擇素的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，若二者的表達(dá)均增加或減少，則從一方面說(shuō)明了實(shí)驗(yàn)結(jié)果正確性。本文所采用的aPL為從APS患者血清中提純的IgG，為排除正常

4、IgG對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，選擇正常人群血清中提純的IgG作為正常對(duì)照。
　　本文擬分為三個(gè)部分，第一部分體外培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC），分別用正常對(duì)照IgG及不同濃度APS患者IgG刺激細(xì)胞，探討不同濃度aPL對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞分泌E-選擇素、IL-6、IL-8、MCP-1的影響。第二部分探討TNF-α干預(yù)下內(nèi)皮細(xì)胞TLR2/4表達(dá)情況其TNF-α干預(yù)下aPL對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌E-選擇素、IL-6、IL-8、MCP-1的影響，進(jìn)一步研究A

5、PS血管內(nèi)皮細(xì)胞活化的機(jī)制，并為治療APS提供新靶點(diǎn)。第三部分通過(guò)研究卡介菌多糖核酸(BCG-PSN)對(duì)aPL刺激內(nèi)皮細(xì)胞分泌E-選擇素、IL-6、IL-8、MCP-1的影響，探討B(tài)CG-PSN是否有可能成為治療APS的新選擇藥物。
　　第一章不同濃度抗磷脂抗體對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞分泌E-選擇素、IL-6、IL-8、MCP-1影響的研究
　　目的:觀察不同濃度抗磷脂抗體對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌功能的影響。
　　方法:體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)

6、皮細(xì)胞，分別用PBS（空白組）、正常人血清提取的IgG（正常對(duì)照組）和不同濃度APS患者血清提取的IgG(APS IgG)（5％、10％和20％）干預(yù)細(xì)胞。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)，檢測(cè)細(xì)胞E-選擇素的表達(dá)，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞分泌MCP-1、IL-6和IL-8的表達(dá)，采用Western blot檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞TLR2和TLR4的表達(dá)。
　　結(jié)果:正常對(duì)照組內(nèi)皮細(xì)胞SELE、MCP-1、IL-6和IL-8表達(dá)量

7、與空白組比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異; APS IgG可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞SELE、MCP-1、IL-6和IL-8表達(dá)增加，與空白組、正常對(duì)照組比較及不同濃度APS IgG組之間兩兩比較，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;空白組、正常對(duì)照組及5％ APS IgG組兩兩比較，內(nèi)皮細(xì)胞TLR2表達(dá)量無(wú)明顯差異，10％及20％ APS IgG組TLR2表達(dá)量與空白組及正常對(duì)照組比較及兩組之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;各組之間TLR4表達(dá)量無(wú)明顯差異。
　　結(jié)論:抗磷

8、脂抗體刺激內(nèi)皮細(xì)胞分泌E-選擇素、IL-6、IL-8、MCP-1增加且作用具有濃度依賴性，濃度越高，作用越強(qiáng)。
　　第二章 TNF-α對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞TLR2/4表達(dá)的影響及APS發(fā)病機(jī)制的研究
　　目的:探討TNF-α干預(yù)下aPL刺激內(nèi)皮細(xì)胞分泌E-選擇素、IL-6、IL-8、MCP-1的情況及TLR2和TLR4在抗磷脂抗體刺激內(nèi)皮細(xì)胞分泌E-選擇素、IL-6、IL-8、MCP-1中的作用。
　　方法:
　　(1)一

9、半細(xì)胞采用腫瘤壞死因子α（TNF-α）預(yù)刺激24小時(shí)后去除刺激因素8小時(shí)，一半細(xì)胞未經(jīng)TNF-α預(yù)刺激但余處理相同，收集一部分TNF-α預(yù)刺激及未預(yù)刺激細(xì)胞，采用Western blot檢測(cè)TNF-α預(yù)處理對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞TLR2和TLR4表達(dá)的影響，余下的TNF-α預(yù)刺激及未預(yù)刺激細(xì)胞分別用脂磷壁酸(LTA)、正常對(duì)照IgG及不同濃度APS IgG（5％、10％和20％）進(jìn)行干預(yù)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)，檢測(cè)細(xì)胞E-選擇素的

10、表達(dá)，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞分泌MCP-1、IL-6和IL-8的表達(dá);
　　(2)分別加入抗-TLR2或（和）抗-TLR4阻斷抗體阻斷TLR2或（和）TLR4信號(hào)傳導(dǎo)通路后，用20％濃度APS IgG干預(yù)細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)，檢測(cè)細(xì)胞E-選擇素的表達(dá)，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞分泌MCP-1、IL-6和IL-8的表達(dá)。
　　結(jié)果:經(jīng)TNF-α預(yù)刺激后，細(xì)胞TLR2表達(dá)量較未經(jīng)TNF-α預(yù)刺激細(xì)

11、胞明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TLR4表達(dá)量無(wú)明顯變化;經(jīng)TNF-α預(yù)處理及未預(yù)處理細(xì)胞均用TLR2特異性激動(dòng)劑LTA進(jìn)行干預(yù)，經(jīng)TNF-α預(yù)處理組SELE、MCP-1、IL-6和IL-8表達(dá)量較未經(jīng)TNF-α預(yù)處理組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;經(jīng)TNF-α預(yù)刺激后再用同濃度APS IgG干預(yù)細(xì)胞，SELE、MCP-1、IL-6和IL-8表達(dá)量與僅用APS IgG干預(yù)組比較明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，不同濃度APS IgG組與正常對(duì)照組

12、四組之間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;抗-TLR2+APS IgG組及抗-TLR2+抗-TLR4組內(nèi)皮細(xì)胞SELE、MCP-1、IL-6和IL-8表達(dá)量，較APS IgG組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;抗-TIR4+ APS IgG組內(nèi)皮細(xì)胞SELE、MCP-1、IL-6和IL-8表達(dá)量，與APS IgG組比較無(wú)明顯改變，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　(1)TNF-α干預(yù)下抗磷脂抗體刺激內(nèi)皮細(xì)胞分泌E-選擇素、IL-6、

13、IL-8、MCP-1的作用增強(qiáng)。
　　(2)抗磷脂抗體通過(guò)TLR2信號(hào)傳導(dǎo)通路刺激內(nèi)皮細(xì)胞使其E-選擇素、IL-6、IL-8、MCP-1分泌增加。
　　第三章卡介菌多糖核酸對(duì)抗磷脂抗體刺激內(nèi)皮細(xì)胞分泌E-選擇素、IL-6、IL-8、MCP-1的影響
　　目的:探討卡介菌多糖核酸(BCG-PSN)干預(yù)下抗磷脂抗體刺激內(nèi)皮細(xì)胞分泌E-選擇素、IL-6、IL-8、MCP-1的情況。
　　方法:用APS患者血清提取的Ig

14、G處理內(nèi)皮細(xì)胞，APS IgG處理前預(yù)先加入不同濃度BCG-PSN（0、25、50和100μg/ml），采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)，檢測(cè)細(xì)胞E-選擇素表達(dá)，采用ELISA測(cè)定細(xì)胞分泌MCP-1、IL-6和IL-8的表達(dá)。
　　結(jié)果:BCG-PSN干預(yù)下APS IgG所誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞SELE、MCP-1、IL-6和IL-8表達(dá)明顯降低，APS IgG組及不同濃度BCG-PSN組之間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。