爪哇根結(jié)線蟲(chóng)Mj-msp-33基因的克隆及功能分析.pdf

1、根結(jié)線蟲(chóng)屬于固著性專(zhuān)性植物寄生線蟲(chóng)，在侵染植物的過(guò)程中分泌多種與寄生相關(guān)的蛋白，稱(chēng)之為效應(yīng)子蛋白。根結(jié)線蟲(chóng)的食道腺是合成效應(yīng)子蛋白的重要場(chǎng)所，其合成的效應(yīng)子蛋白往往具有N端信號(hào)肽，被分泌到食道中，最后通過(guò)口針注入植物體內(nèi)。研究這些效應(yīng)子蛋白的功能和作用，有助于人們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)根結(jié)線蟲(chóng)與植物互作的分子機(jī)制，進(jìn)而為根結(jié)線蟲(chóng)的防治提供理論基礎(chǔ)。本論文根據(jù)南方根結(jié)線蟲(chóng)（Meloidogyne incognita）Mi-msp33基因的序列，利用同

2、源克隆和RACE方法，從爪哇根結(jié)線蟲(chóng)（Meloidogyne javanica）中成功克隆了同源基因Mj-msp33，并獲得了Mj-msp33全長(zhǎng)cDNA序列。Mi-msp33基因片段的編碼序列只有N端部分333 bp，本文獲得的Mj-msp33基因的ORF全長(zhǎng)1326 bp，編碼一個(gè)442 aa的蛋白。
　　Mj-msp33蛋白是一個(gè)新的爪哇根結(jié)線蟲(chóng)候選效應(yīng)子蛋白，具有N端信號(hào)肽和一個(gè)pat4：KKHK核定位信號(hào)（NLS）。利用

3、網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源比對(duì)，除了Mi-msp33蛋白，未在其它線蟲(chóng)種類(lèi)和其它物種上發(fā)現(xiàn)與之同源的蛋白。通過(guò)原位雜交（In-situ Hybridization）、齡期表達(dá)分析和酵母雙雜交（Yeast two-hybrid）等方法，對(duì)Mj-msp33基因的功能進(jìn)行了初步的鑒定。
　　利用地高辛（Digoxin）標(biāo)記的特異性探針，進(jìn)行原位雜交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，Mj-msp33在爪哇根結(jié)線蟲(chóng)侵染前二齡幼蟲(chóng)（pre-J2）的亞腹食道腺特異表達(dá)。

4、齡期表達(dá)分析結(jié)果顯示，Mj-msp33在爪哇根結(jié)線蟲(chóng)侵染前二齡幼蟲(chóng)（pre-J2）和侵染早期階段（2dpi）表達(dá)量最高，以及在侵染后二齡幼蟲(chóng)（5dpi）表達(dá)量也比較高；此后隨著線蟲(chóng)的發(fā)育，Mj-msp33的表達(dá)量逐漸降低，成熟雌蟲(chóng)時(shí)期表達(dá)量最低。
　　利用酵母雙雜交系統(tǒng)，通過(guò)構(gòu)建爪哇根結(jié)線蟲(chóng) Mj-msp33的誘餌融合蛋白，進(jìn)行酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)，篩選到一個(gè)與 Mj-msp33蛋白存在相互作用的擬南芥（Arabidopsis thal