南方根結(jié)線蟲(chóng)效應(yīng)蛋白Misp12功能分析和淡紫紫孢菌寄生適應(yīng)性的比較基因組研究.pdf

1、根結(jié)線蟲(chóng)是一類重要的植物寄生線蟲(chóng)，能寄生植物根部形成根結(jié)，造成作物減產(chǎn)。線蟲(chóng)致病機(jī)理和生防菌殺蟲(chóng)機(jī)制是植物線蟲(chóng)學(xué)研究的兩個(gè)重要領(lǐng)域。對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)致病相關(guān)機(jī)理，如寄生相關(guān)基因特別是分泌效應(yīng)蛋白等的研究，可以更好的了解根結(jié)線蟲(chóng)寄生過(guò)程中相關(guān)基因的調(diào)控，篩選出新的靶標(biāo)基因?yàn)殚_(kāi)發(fā)新型防治線蟲(chóng)藥劑提供參考依據(jù)。同時(shí)，對(duì)線蟲(chóng)生防菌的寄生機(jī)理研究，有助于通過(guò)遺傳改造提高生防菌的效果。
　　本論文通過(guò)生物信息學(xué)方法挖掘了南方根結(jié)線蟲(chóng)(Meloido

2、gyne incognita)效應(yīng)蛋白Misp12并對(duì)其功能進(jìn)行了驗(yàn)證;通過(guò)基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序解析了線蟲(chóng)卵寄生真菌淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)卵寄生過(guò)程中的相關(guān)基因表達(dá)和對(duì)多種環(huán)境適應(yīng)性的組學(xué)基礎(chǔ)。
　　根結(jié)線蟲(chóng)在寄生取食植物根部時(shí)，分泌蛋白起著關(guān)鍵性的作用?，F(xiàn)階段的線蟲(chóng)效應(yīng)蛋白研究集中在早期寄生過(guò)程中，少有對(duì)后期寄生過(guò)程中的效應(yīng)蛋白的研究。本文通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)得到南方根結(jié)線蟲(chóng)效應(yīng)子Misp1

3、2，然后進(jìn)行克隆測(cè)序和表達(dá)動(dòng)態(tài)分析，采用細(xì)胞定位和VIGS等試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行了功能驗(yàn)證，研究發(fā)現(xiàn)Misp12基因基因長(zhǎng)度為1202 bp，編碼149個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的蛋白質(zhì)，該基因在南方根結(jié)線蟲(chóng)中高度保守，基因少有突變;編碼的蛋白由線蟲(chóng)的背腹食道腺特異表達(dá)，且在線蟲(chóng)成熟期即雌蟲(chóng)時(shí)期有相當(dāng)高的表達(dá)量;亞細(xì)胞定位表明ΔspMisp12-GFP融合蛋白定位在植物細(xì)胞質(zhì)中;VIGS沉默Misp12基因后根結(jié)數(shù)量、線蟲(chóng)數(shù)量和產(chǎn)卵量都有減少，尤其是雌蟲(chóng)數(shù)目

4、減少最多;沉默后對(duì)相關(guān)信號(hào)途徑的防御基因進(jìn)行qRT-PCR，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于對(duì)照組，沉默Misp12基因煙草植株防御基因都上調(diào)表達(dá)，而在煙草葉片上瞬時(shí)表達(dá)該基因能夠抑制由INF1引起的細(xì)胞程序性死亡，該過(guò)程中植物細(xì)胞的SA信號(hào)途徑基因會(huì)被抑制表達(dá)，說(shuō)明該基因可能抑制了植物防御基因的表達(dá)。
　　作為一種能夠寄生線蟲(chóng)卵的真菌，淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)有很高的生防價(jià)值?，F(xiàn)在已有淡紫紫孢菌的生防制劑注冊(cè)面

5、市，但是該菌寄生線蟲(chóng)卵的機(jī)制仍不明確。本文通過(guò)對(duì)Illumina測(cè)序的淡紫紫孢菌的基因組和寄生線蟲(chóng)卵早期的轉(zhuǎn)錄組的比較分析發(fā)現(xiàn)淡紫紫孢菌與昆蟲(chóng)病原真菌親緣關(guān)系近，尤其與冬蟲(chóng)夏草的親緣關(guān)系最近，在74～94百萬(wàn)年前出現(xiàn)物種分離;與來(lái)自印度的測(cè)序菌株全基因組比對(duì)分析表明36-1的基因組具有更多的序列重排及SNP;淡紫紫孢菌重復(fù)序列誘導(dǎo)點(diǎn)突變(RIP)機(jī)制較弱，在進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)受的選擇壓力較低;相對(duì)于其他真菌，淡紫紫孢菌富含絲氨酸蛋白酶、幾丁質(zhì)

6、降解酶類、膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因;對(duì)附著胞形成相關(guān)基因表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)有357個(gè)基因被鑒定為附著胞相關(guān)基因，并且在侵染過(guò)程中起作用，其中有27個(gè)基因具有4倍以上的表達(dá)量;轉(zhuǎn)錄組分析表明淡紫紫孢菌寄生線蟲(chóng)的模式可能與綠僵菌屬真菌侵染昆蟲(chóng)相一致，在侵染過(guò)程中可能會(huì)受到線蟲(chóng)胚胎的氧化防御反應(yīng); GO富集分析發(fā)現(xiàn)上調(diào)的基因主要集中在氧化還原活性，核糖體結(jié)構(gòu)成分，轉(zhuǎn)移酶活性以及膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性上，KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)上調(diào)表達(dá)基因主要集中在能量、氨基