根結(jié)線蟲寄生真菌資源與淡紫擬青霉PL89的研究.pdf

1、從全省9個縣(市)18種作物上根結(jié)線蟲的雌蟲、卵和卵囊上共獲得888個寄生性真菌分離物，隸屬于26屬，鑒定出17種，3個變種.其中厚垣孢普可尼亞菌(Pochoniachlamydosporia)、淡紫擬青霉(Paecilomyceslilacinus)、茄病鐮孢(Fusariumsolani)和尖孢鐮孢(F.oxysporum)是福建省根結(jié)線蟲的寄生性真菌優(yōu)勢種群，分別占分離物總數(shù)的22.30％、19.14％、17.23％和9.57％.

2、根結(jié)線蟲的寄生真菌類型以卵囊寄生真菌為主.從175株厚垣孢普可尼亞菌(P.chlamydosporia)鑒定出厚孢變種(P.chlamydosporiavar.chlamydosporia)143株和串孢變種(P.chlamydosporiavar.catenulata)32株，其中厚孢變種為優(yōu)勢變種.厚孢變種與串孢變種在自然界中存在的比例為4.47∶1. 構(gòu)建“幾丁質(zhì)平板篩選、幾丁質(zhì)酶活測定、對根結(jié)線蟲致病力測定”的寄生性真菌

3、高效菌株篩選模型，從123株淡紫擬青霉分離物中篩選獲得5株高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶、對根結(jié)線蟲高致病力的菌株021117-89(即PL89)、021117-77、021029-27、021020-65、021020-36.采用明膠瓊脂平板法與幾丁質(zhì)平板法相結(jié)合，從175株厚垣孢普可尼亞菌分離物中篩選獲得5株產(chǎn)蛋白酶能力與產(chǎn)幾丁質(zhì)酶能力均較強的菌株010727-1、021020-30、021120-48、021020-34、021120-81.對菌株

4、PL89的發(fā)酵生物學(xué)特性的研究結(jié)果表明，PL89液體發(fā)酵的適宜C/N為5∶1，C/N為20∶1有利于PL89固體平板的產(chǎn)孢；碳源濃度對PL89液體培養(yǎng)大量產(chǎn)孢出現(xiàn)的時間和持續(xù)的時間有一定的影響，碳源濃度為1mol·L-1可使液體發(fā)酵大量產(chǎn)孢時間提前，適宜PL89固體平板產(chǎn)孢的碳源濃度為0.5mol·L-1；菌株對不同的碳、氮源種類利用能力不同，結(jié)構(gòu)復(fù)雜的碳源(可溶性淀粉)及有機氮源有利于PL89的生長；主要元素缺失對菌株P(guān)L89的生長影

5、響很大，其中缺失磷、硫和鎂等元素對PL89的液體發(fā)酵產(chǎn)孢的減產(chǎn)率分別達90.8％，90.6％和83.1％，對固體平板的產(chǎn)孢減產(chǎn)率分別為83.6％，59.8％和58.8％；微量元素添加培養(yǎng)試驗結(jié)果表明，菌株P(guān)L89對銅離子和鋁離子較敏感，添加一定濃度的錳離子、鎂離子和元素硼對PL89液體發(fā)酵的產(chǎn)孢及生物量的形成有顯著的促進作用；添加適當(dāng)濃度的維生素葉酸和維生素B2均十分有利于PL89液體發(fā)酵孢子產(chǎn)量的增加. 根據(jù)PL89菌株營養(yǎng)需

6、求特性，研制了蝦殼粉培養(yǎng)基.通過單因素試驗證明細度為過孔徑為149μm標準篩的幾丁質(zhì)粉末對菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的誘導(dǎo)性最強，同時添加蛋白胨能使產(chǎn)酶高峰提早、產(chǎn)酶量提高；多因素正交試驗確定在添加2g·L-1細度為過孔徑為149μm標準篩的幾丁質(zhì)粉末、2g·L-1蛋白胨、1g·L-1KH2PO4、0.5g·L-1MgSO4、0.2g·L-1CaCl2和0.2g·L-1NaCl的培養(yǎng)基中接入經(jīng)馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(PSA)活化10d的菌碟，接種量為6×

7、109個孢子·L·1，500mL搖瓶裝量150mL，在28℃、轉(zhuǎn)速為150r·min-1的條件下培養(yǎng)3d，發(fā)酵液中幾丁質(zhì)酶活最高，可達到0.11U·mL-1. 用菌株篩選模型獲得的PL89菌株具有很強的分解和利用幾丁質(zhì)的能力，適合在以蝦殼為主要成分的蝦殼粉培養(yǎng)基上生長·通過對蝦殼粉的成分進行測定分析，結(jié)果表明，蝦殼粉培養(yǎng)基所含的營養(yǎng)全面，碳源濃度和碳氮源比率適合；實驗結(jié)果表明，蝦殼粉培養(yǎng)基比馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基更適宜于菌株P(guān)L89液

8、體發(fā)酵的產(chǎn)孢及生物量的形成；用蝦殼粉作為唯一的營養(yǎng)來源液體發(fā)酵PL89，發(fā)酵過程無需流加營養(yǎng)和消泡處理，并且發(fā)酵過程中蝦殼粉培養(yǎng)基顯示出良好的pH緩沖性能，使用方便、價格低廉. 建立了“蝦殼粉為液體發(fā)酵培養(yǎng)基，以谷殼、麩皮為固體培養(yǎng)基，固體開放式培養(yǎng)，空調(diào)法干燥，無塵粉碎收孢”的淡紫擬青霉菌株P(guān)L89雙相發(fā)酵工藝體系. 一定條件下，采用蝦殼粉為培養(yǎng)基的液體發(fā)酵技術(shù)可實現(xiàn)淡紫擬青霉菌株P(guān)L89的微循環(huán)產(chǎn)孢，液體發(fā)酵罐發(fā)酵7

9、2h芽生孢子產(chǎn)量可達到11.43×108個·mL-1；菌絲球數(shù)量可達到7833個·mL-1.PL89液體發(fā)酵過程中除可以產(chǎn)生芽生孢子和液生分生孢子外，還能產(chǎn)生一種不易被觀察到的，大小僅為(1.0～1.2)μm×(0.4～0.6)μm的“節(jié)孢子”. 開放式固體發(fā)酵7d的產(chǎn)孢量可以達到85.73～136.67億個·g-1，實現(xiàn)快速大量產(chǎn)孢.創(chuàng)制了淡紫擬青霉PL89可濕性粉劑.通過對載體、助劑等進行篩選，對影響潤濕性和懸浮性的因素進行

10、分析，對可濕性粉劑進行配伍，研制出以硅藻土為載體、木質(zhì)素磺酸鈉和NE-2分別作為分散劑和潤濕劑的淡紫擬青霉PL89可濕性粉劑.通過測定，該制劑的平均潤濕時間為10.24(±0.13)min，平均懸浮率為78.49(±0.54)％，含孢量為1.5(±0.076)×109個·g-1，在土壤中的滲透能力明顯優(yōu)于未經(jīng)劑型加工的粉劑.該制劑能有效地防治黃瓜和番茄的根結(jié)線蟲病，對黃瓜和番茄根結(jié)線蟲病的相對防效分別達到72.5％和76.9％.同時，菌

11、株P(guān)L89在土壤、植株根際和根表具有良好的定殖能力，菌株還能在植株的根內(nèi)定殖. 試驗結(jié)果表明，菌株P(guān)L89有較強的抗逆性和對化學(xué)農(nóng)藥的兼容性.菌株P(guān)L89在pH值4～13范圍內(nèi)的培養(yǎng)基上均可以生長；有較強的耐鹽堿能力；菌株在40℃和50℃條件下的LT50分別為77.1min和45.3min.菌株對化學(xué)殺線劑益舒寶和除草劑草甘膦的相容性較好，其EC50分別為10.412mg·mL-1和4.399mg·mL-1；對殺菌劑多菌靈、除草