原發(fā)性腎病綜合征遺傳學(xué)基礎(chǔ)探討——NPHS2、WT1和PLCE1基因突變分析.pdf

1、第一部分中國(guó)南方漢族人家族性激素耐藥型腎病綜合征家系NPHS2基因突變分析
　　 目的：原發(fā)性腎病綜合征(primary nephrotic syndrome,PNS)是兒童時(shí)期最常見的腎小球疾病,根據(jù)患兒對(duì)糖皮質(zhì)激素治療的療效,PNS被分成激素敏感型腎病綜合征(steroid-sensitive nephrotic syndrome,SSNS)和激素耐藥型腎病綜合征(steroid-resistant nephrotic sy

2、ndrome,SRNS)。為探討中國(guó)南方漢族人家族性SRNS家系NPHS2基因突變及其特點(diǎn),我們對(duì)3個(gè)中國(guó)南方漢族人家族性SRNS家系進(jìn)行了NPHS2基因突變分析。
　　 方法：研究對(duì)象為A、B、C 3個(gè)南方漢族人SRNS家系先證者及其姐姐和父母,50例尿檢正常的南方漢族健康成年人作為對(duì)照人群。取所有研究對(duì)象外周靜脈血3ml,10％枸櫞酸鈉抗凝,提取基因組DNA。應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reacti

3、on,PCR)擴(kuò)增NPHS2基因全部8個(gè)外顯子及其周圍的部分內(nèi)含子和啟動(dòng)子全長(zhǎng)序列(大約2.6kb),對(duì)PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行DNA序列測(cè)定。
　　 結(jié)果：對(duì)3個(gè)南方漢族人SRNS家系先證者NPHS2基因全部8個(gè)外顯子及其周圍的部分內(nèi)含子進(jìn)行突變分析,未發(fā)現(xiàn)NPHS2基因致病突變,僅在外顯子8上檢測(cè)到1個(gè)NPHS2基因多態(tài)性(954T>C)。在3個(gè)家系的先證者及其姐姐和父母的NPHS2基因啟動(dòng)子上檢測(cè)到6個(gè)變異:-1715A>G、-

4、1709G>A、-1000A>T、-670C>T、-116C>T和-51G>T。
　　 結(jié)論：本研究對(duì)3個(gè)中國(guó)南方漢族人常染色體隱性遺傳的SRNS家系先證者的NPHS2基因的全部8個(gè)外顯子及其周圍的部分內(nèi)含子和啟動(dòng)子全長(zhǎng)進(jìn)行了突變分析,未發(fā)現(xiàn)NPHS2基因致病突變,但在外顯子8發(fā)現(xiàn)了一個(gè)已報(bào)道的基因多態(tài)性,在啟動(dòng)子新發(fā)現(xiàn)了1個(gè)變異和1個(gè)基因多態(tài)性以及4個(gè)已報(bào)道的基因多態(tài)性,提示NPHS2基因突變不是本研究3個(gè)SRNS家系的主要致

5、病因?yàn)椤?br>　　 第二部分 中國(guó)漢族人家族性激素耐藥型腎病綜合征家系WT1基因突變分析
　　 目的：PNS是兒童時(shí)期最常見的腎小球疾病,其主要臨床特征為大量蛋白尿。大約10％～20％PNS患兒對(duì)激素治療耐藥,即SRNS,其中大部分患兒逐漸進(jìn)展到ESRD。NPHS2是常染色體隱性遺傳型家族性SRNS的常見致病基因之一,但由于遺傳背景的差異,部分家族性SRNS非NPHS2基因突變所致。WT1是一種鋅指樣轉(zhuǎn)錄因子,研究表明它是足

6、細(xì)胞的兩個(gè)特異基因(NPHS1和NPHS2)的上游調(diào)節(jié)基因,在SRNS的發(fā)生過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。WT1基因突變可引起Denys-Drash綜合征等多種腎小球疾病。我們對(duì)3個(gè)中國(guó)漢族人家族性SRNS家系進(jìn)行了WT1基因突變分析。
　　 方法：研究對(duì)象為A、B、C 3個(gè)中國(guó)南方漢族人SRNS家系的先證者及其姐和父母,50例尿檢正常的中國(guó)南方漢族健康成年人作為對(duì)照人群。取所有研究對(duì)象外周靜脈血3ml,10％枸櫞酸鈉抗凝,提取基因

7、組DNA。PCR方法擴(kuò)增WT1基因全部10個(gè)外顯子及其周圍的部分內(nèi)含子,PCR方法擴(kuò)增WT1基因全部10個(gè)外顯子及其周圍的部分內(nèi)含子,應(yīng)用對(duì)PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行DNA序列測(cè)定法和PCR/限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法(PCR-RFLP)檢測(cè)WT1基因變異。
　　 結(jié)果：對(duì)3個(gè)中國(guó)漢族人SRNS家系的先證者WT1基因全部10個(gè)外顯子及其周圍的部分內(nèi)含子進(jìn)行突變分析,未發(fā)現(xiàn)WT1基因致病突變,但在3個(gè)SRNS家系的先證者WT1基因外顯子檢

8、測(cè)到2個(gè)變異-126C>T(P42P)和903A>G(R300R)。這2個(gè)變異在100條正常染色體中也有檢出,提示它們均為WT1基因多態(tài)性。在家系C的先證者WT1基因內(nèi)含子區(qū)檢測(cè)到1個(gè)變異-IVS5-64A>G。這個(gè)變異在100條正常染色體中也有檢出,提示它亦為WT1基因多態(tài)性。126C>T、903A>G和IVS5-64A>G多態(tài)性在對(duì)照人群中的等位基因頻率分別為0.67、0.71和0.02。126C>T和903A>G多態(tài)性已見文獻(xiàn)報(bào)道

9、,IVS5-64A>G為新發(fā)現(xiàn)的WT1基因多態(tài)性。
　　 結(jié)論：本研究對(duì)3個(gè)中國(guó)漢族人常染色體隱性遺傳型SRNS家系先證者的WT1基因的全部10個(gè)外顯子及其周圍的部分內(nèi)含子進(jìn)行了突變分析,未發(fā)現(xiàn)WT1基因致病突變,但發(fā)現(xiàn)了2個(gè)已經(jīng)報(bào)道的WT1基因多態(tài)性和1個(gè)新發(fā)現(xiàn)的WT1基因多態(tài)性,提示W(wǎng)T1基因突變不是本研究3個(gè)SRNS家系的主要致病因?yàn)椤?br>　　 第三部分 中國(guó)漢族人家族性激素耐藥型腎病綜合征家系PLCE1基因突變分析

10、
　　 目的：PNS是兒童時(shí)期最常見的腎小球疾病,約10％～20％PNS患兒對(duì)激素治療耐藥(SRNS),其中大部分患兒逐漸進(jìn)展到ESRD,需要腎替代治療如透析或腎移植生存。迄今,已經(jīng)證實(shí)有8個(gè)不同的單基因突變能夠?qū)е氯祟怱RNS,它們分別為NPHS1、LAMβ2、CD2AP、ACTN4、TRPC6、NPHS2、WT1和PLCE1基因；其中NPHS1、LAMβ2、CD2AP、NPHS2、WT1和PLCE1基因突變可以引起常染色體隱

11、性遺傳型SRNS。鑒于國(guó)際上有發(fā)現(xiàn)PLCE1基因突變可引起家族性SRNS,發(fā)病年齡為0.2歲～8.8歲,而國(guó)內(nèi)尚未見對(duì)SRNS兒童進(jìn)行PLCE1基因突變分析的報(bào)道,為進(jìn)一步分析我國(guó)漢族人家族性SRNS家系的致病基因及其特點(diǎn),我們?cè)趯?duì)3個(gè)常染色體隱性遺傳的SRNS家系進(jìn)行NPHS2和WT1基因突變分析之后,又對(duì)他們進(jìn)行了PLCE1基因突變分析。
　　 方法：研究對(duì)象為A、B、C 3個(gè)南方漢族人SRNS家系先證者及其姐姐和父母,50

12、例尿檢正常的南方漢族健康成年人作為對(duì)照人群。取所有研究對(duì)象外周靜脈血3ml,10％枸櫞酸鈉抗凝,提取基因組DNA。PCR方法擴(kuò)增PLCE1基因全部31個(gè)編碼外顯子及其周圍的部分內(nèi)含子區(qū)。應(yīng)用對(duì)PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行DNA序列測(cè)定法和PCR-RFLP方法檢測(cè)PLCE1基因變異。
　　 結(jié)果：對(duì)3個(gè)中國(guó)漢族人SRNS家系先證者在3個(gè)家系的先證者PLCE1基因的全部31個(gè)編碼外顯子及其周圍的部分內(nèi)含子進(jìn)行突變分析,未發(fā)現(xiàn)PLCE1基因致病

13、突變,但檢測(cè)到13個(gè)變異。
　　 結(jié)論：本研究對(duì)3個(gè)中國(guó)漢族人常染色體隱性遺傳型SRNS家系先證者PLCE1基因的全部編碼外顯子及其周圍的部分內(nèi)含子進(jìn)行了突變分析,未發(fā)現(xiàn)PLCE1基因致病突變,但發(fā)現(xiàn)了12個(gè)已報(bào)道的和1個(gè)新發(fā)現(xiàn)的PLCE1基因多態(tài)性,提示PLCE1基因突變也不是本研究3個(gè)漢族人SRNS家系的主要致病因子。
　　 第四部分 中國(guó)南方漢族人散發(fā)性激素耐藥型腎病綜合征兒童NPHS2基因突變分析
　　

14、目的：PNS是兒童時(shí)期最常見的腎小球疾病,臨床表現(xiàn)為大量蛋白尿、低蛋白血癥、高膽固醇血癥和不同程度的浮腫。80％～90％PNS患兒對(duì)激素治療敏感,預(yù)后良好；然而,10％～20％PNS患兒對(duì)激素治療耐藥,即SRNS。為分析我國(guó)南方漢族人散發(fā)性SRNS兒童NPHS2基因突變及其特點(diǎn),我們對(duì)收集到的15例中國(guó)南方漢族人散發(fā)性SRNS兒童進(jìn)行了NPHS2基因突變分析。
　　 方法：研究對(duì)象為15例南方漢族人散發(fā)性SRNS兒童,50例尿檢

15、正常的南方漢族健康成年人作為對(duì)照人群。取所有研究對(duì)象外周靜脈血3ml,10％枸櫞酸鈉抗凝,提取基因組DNA。
　　 結(jié)果：對(duì)15例南方漢族人散發(fā)性SRNS兒童NPHS2基因全部8個(gè)外顯子及其周圍的部分內(nèi)含子進(jìn)行突變分析,未發(fā)現(xiàn)NPHS2基因致病突變,但在其中13例SRNS兒童的NPHS2基因外顯子上檢測(cè)到兩個(gè)變異。
　　 結(jié)論：本研究對(duì)15例中國(guó)南方漢族人散發(fā)性SRNS患兒NPHS2基因的全部外顯子及其周圍的部分內(nèi)含子進(jìn)

16、行突變分析,未發(fā)現(xiàn)NPHS2基因致病突變,但檢測(cè)到2個(gè)已報(bào)道的NPHS2基因多態(tài)性,提示NPHS2基因突變不是本研究15例中國(guó)南方漢族人散發(fā)性SRNS兒童的主要致病因?yàn)椤?br>　　 第五部分 激素依賴型腎病綜合征兒童NPHS2基因突變分析
　　 目的：為了進(jìn)一步探討中國(guó)SDNS兒童NPHS2基因突變及其特點(diǎn),我們對(duì)1例中國(guó)SDNS兒童進(jìn)行了NPHS2基因突變分析。
　　 方法:研究對(duì)象為1例SDNS患兒及其父母、弟弟

17、,50例尿檢正常成年人。分別取所有研究對(duì)象的外周靜脈血各3ml,10％枸櫞酸鈉抗凝,提取基因組DNA。應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增患兒NPHS2基因的全部8個(gè)外顯子及其啟動(dòng)子全長(zhǎng),對(duì)PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行DNA序列測(cè)定。
　　 結(jié)果：在SDNS患兒NPHS2基因外顯子5上檢測(cè)到1個(gè)雜合錯(cuò)義突變-596A>T；在NPHS2基因外顯子8上檢測(cè)到1個(gè)雜合同義突變-954T>C(A318A)。此外,在該患兒NPHS2基因啟動(dòng)子區(qū)檢測(cè)到-116C>T純

18、合變異。其母親和弟弟NPHS2基因上也檢測(cè)到596A>T的雜合錯(cuò)義突變和954T>C雜合同義突變。其母親NPHS2基因啟動(dòng)子區(qū)也檢測(cè)到-116C>T純合變異。在其父親和弟弟NPHS2基因啟動(dòng)子區(qū)檢測(cè)到-116C>T雜合變異。但患兒的父母和弟弟尿檢均正常。
　　 結(jié)論：本研究在1例SDNS中國(guó)兒童NPHS2基因編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)了1個(gè)N199I雜合錯(cuò)義突變和1個(gè)A318A雜合同義突變,在啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)了-116C>T純合變異、提示該腎病綜合