牙鲆淋巴囊腫病毒在牙鲆鰓細胞系（FG）中的增殖以及在魚體中組織嗜親性研究.pdf

1、牙鲆(Paralichthys olivaceus)，英文名為Olive flounder，Bastard halibut，Japanese flounder等。在我國俗稱牙片、偏口、比目魚，因其體色又名褐牙鲆，是名貴的海產(chǎn)魚類，又是重要的海水增養(yǎng)殖魚類之一。淋巴囊腫病是近年來對我國沿海養(yǎng)殖魚類危害較大的一種病毒性疾病，其病原為淋巴囊腫病毒(Lvmphocystis disease virus，LCDV)。20世紀90年代，淋巴囊腫病的

2、爆發(fā)給我國牙鲆養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。 本文使用牙鲆鰓細胞系(Flounder gill，F(xiàn)G)進行病毒培養(yǎng)，在光鏡下可見培養(yǎng)細胞有明顯CPE癥狀出現(xiàn)。將培養(yǎng)細胞收集、超薄切片后進行電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)細胞中有典型的呈五邊形或六邊形的病毒粒子，大小為220～290 nm，衣殼大小為190～240 nm，其核心直徑為130一140 nm。在胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)病毒的包涵體。收集接種病毒后的培養(yǎng)細胞，酚／氯仿法提取DNA后，根據(jù)編碼LCDV

3、主要衣殼蛋白(Major capsidprotein，MCP)基因中間保守序列設計引物，通過PCR擴增，獲得454 bp長度的特異性DNA片段。證明FG細胞可以作為LCDV的敏感細胞系。 對LCDV在體外培養(yǎng)FG細胞中的增殖周期進行了研究，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)病毒感染并吸附細胞后8 h內(nèi)即可完成一個復制周期。接種病毒后2 h的細胞結構完整，細胞器沒有病變，細胞內(nèi)未觀察到病毒粒子，但可觀察到大量病毒正在吸附及侵入培養(yǎng)細胞，病毒形態(tài)規(guī)則，大

4、小在220～290 nm之間。接種6 h的細胞形態(tài)仍然正常，細胞器沒有明顯病變，病毒大都在侵入細胞，在細胞質(zhì)內(nèi)可見形態(tài)典型的病毒粒子，表明有些病毒已侵入細胞，胞質(zhì)內(nèi)病毒粒子大小也在220～290nm之間，與細胞外病毒大小沒有明顯差別。接種10 h的細胞內(nèi)開始出現(xiàn)大量病毒粒子，病毒的大量復制和釋放導致宿主細胞出現(xiàn)顯著的病理變化，線粒體空泡化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)網(wǎng)池擴張。接種24 h的細胞內(nèi)病毒數(shù)目很多，大多數(shù)病毒正在釋放。 接種14d病毒的形

5、態(tài)開始改變，為非典型的二十面體。病毒增殖周期的PCR檢測結果也符合電鏡結果。通過細胞培養(yǎng)研究LCDV體外增殖周期尚未見報道。本文根據(jù)葡萄球菌蛋白A能與牙鲆IgM抗體特異性結合的性質(zhì)，進行感染灶實驗(FIA，focal infectivity assay)，能夠靈敏的檢測到培養(yǎng)細胞中的LCDV。通過FIA的方法檢測培養(yǎng)細胞中的LCDV尚未見報道。 本文通過MTT比色法測定了FG細胞在感染LCDV后的活性，具體反映為580nM處的光

6、吸收值，并根據(jù)Reed-Muench法和Karber統(tǒng)計法分別計算了LCDV的細胞培養(yǎng)半數(shù)致死量(50％cell culture infectious dose，CCID50)，以CCID50來表示病毒的滴度。目前尚未見有利用MTT比色法測定LCDV滴度的報道。 本文還利用電鏡技術和PCR對淋巴囊腫病毒侵染牙鲆的組織嗜親性進行了研究，發(fā)現(xiàn)鰓、肌肉、頭腎、體腎、脾、腸、胃、心臟、精巢和膽囊為病毒的靶器官。在肝臟中未觀察到病毒粒子，