三種增塑劑(DEHP、DBP和TBAC)對(duì)牙鲆鰓細(xì)胞FG和斑馬魚(yú)胚胎的毒性作用研究.pdf

1、增塑劑（又稱塑化劑），是一類工業(yè)用高分子材料助劑，被廣泛添加到塑料制品中以提高塑料的柔韌性。因其在環(huán)境中的高遷移性，現(xiàn)已成為地球上最廣泛存在的污染物之一。2011年臺(tái)灣所爆發(fā)的“增塑劑風(fēng)波”，進(jìn)一步激起了全社會(huì)對(duì)增塑劑毒性的廣泛關(guān)注。由于水生生物大都是體外產(chǎn)卵、體外受精和體外發(fā)育，而增塑劑的生殖毒性和發(fā)育毒性可能會(huì)嚴(yán)重影響水生生物種群的未來(lái)。目前有關(guān)增塑劑對(duì)水生生物毒性的研究報(bào)道還很少，也缺乏系統(tǒng)有效的針對(duì)增塑劑類污染物毒性特點(diǎn)的生物評(píng)

2、價(jià)技術(shù)和體系，這很不利于人們對(duì)增塑劑毒性的預(yù)防和管理工作。
　　本文首先利用海水魚(yú)類牙鲆的鰓細(xì)胞系（FG）比較研究了3種增塑劑鄰苯二甲酸二乙基己酯（DEHP）、鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）和乙酰檸檬酸三丁酯（TBAC）的急性細(xì)胞毒性效應(yīng)，采用MTT法、中性紅（NR）吸收法、乳酸脫氫酶（LDH）釋放法、吖啶橙/溴化乙錠（AO/EB）雙熒光染色法和DNA ladder法，分別檢測(cè)了以上三種增塑劑對(duì)牙鲆鰓FG細(xì)胞的活性影響、生長(zhǎng)抑制、細(xì)胞

3、膜損傷和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)。
　　從細(xì)胞形態(tài)上觀察，這三種增塑劑都會(huì)對(duì)FG產(chǎn)生細(xì)胞毒性，隨著處理濃度的升高和時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞皺縮變圓的數(shù)目也逐漸增多，說(shuō)明這三種增塑劑的細(xì)胞毒性具有一定的濃度效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)。這三者的最低效應(yīng)濃度（LOEC）分別為：DEHP為150μg/mL，DBP為50μg/mL，TBAC為150μg/mL。
　　MTT法分析結(jié)果表明，以上3種增塑劑對(duì)FG細(xì)胞的活性均有抑制作用，但濃度較低時(shí)（0.005~50μ

4、g/mL），抑制作用不明顯，并且這三者之間沒(méi)有明顯的毒性差異，其在24 h和48 h的細(xì)胞活性抑制率分別約為96％和94%。當(dāng)濃度達(dá)到150μg/mL時(shí)，才表現(xiàn)出明顯的抑制作用，其毒性等級(jí)為：DBP>TBAC>DEHP。DEHP、DBP和TBAC對(duì)FG細(xì)胞24 h的抑制率分別為：96±0.19%、80.8±3.7%和91.9±3.9%；48 h的抑制率分別為：94.8±1.5%、62.8±2.5%和73.8±0.58%。這表明，以上3種

5、增塑劑對(duì)FG細(xì)胞活性的抑制作用具有明顯的時(shí)間效應(yīng)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)FG細(xì)胞的抑制作用增強(qiáng)。
　　中性紅（NR）吸收法分析結(jié)果表明，以上3種增塑劑都可以抑制 FG細(xì)胞的生長(zhǎng)，而且這種抑制作用具有明顯的濃度依賴性和時(shí)間依賴性，且毒性等級(jí)為：DBP>TBAC>DEHP。在0.005μg/mL時(shí)，DEHP、DBP和TBAC對(duì)FG細(xì)胞24 h的抑制率分別為：96.7±0.79%，95.8±0.65%和95.9±1.1%；48 h的抑制率分

6、別為95.9±1.1%，93.3±0.8%和94.1±1.4%。DEHP、DBP和TBAC對(duì)FG細(xì)胞的24 h的IC50（半數(shù)抑制濃度）值分別為：290.4（242.0-348.6）、144.8（99.23-211.2）和217（176.3-267.2）μg/mL（95%的置信區(qū)間）；48 h的IC50值分別為：213.8（166.6-274.3）、108.3（71.05-165.0）和135.8（97.54-189.1）μg/mL（9

7、5%的置信區(qū)間）?？梢?jiàn)，中性紅吸收法更適合檢測(cè)這三種增塑劑對(duì) FG細(xì)胞的毒性作用。
　　乳酸脫氫酶（LDH）釋放法分析結(jié)果表明，隨著三種增塑劑濃度的升高，處理組FG細(xì)胞中的培養(yǎng)基上清中乳酸脫氫酶含量也隨之升高，具有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，其毒性等級(jí)也為：DBP>TBAC>DEHP。0.005μg/mL的DEHP、DBP和TBAC處理FG細(xì)胞24 h后的LDH相對(duì)活性最低，分別為：21.1±5.8%、33.4±0.8%和30.2±0.8

8、%；而150μg/mL的DEHP、DBP和TBAC處理FG細(xì)胞24 h后的相對(duì)活性最高，分別為：48.4±0.5%、72.6±1.6%和52.2±5.7%。以上結(jié)果表明，3種增塑劑可破壞FG細(xì)胞的細(xì)胞膜，使細(xì)胞膜的完整性遭到破壞，致使FG細(xì)胞質(zhì)中的LDH被釋放到培養(yǎng)基上清中。
　　AO/EB雙熒光染色結(jié)果表明，這三種增塑劑對(duì) FG細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)很低，最高濃度（150μg/mL）的DEHP、DBP和TBAC處理FG細(xì)胞24 h后

9、的凋亡誘導(dǎo)率分別為：2.4%、28%和6%。因此，沒(méi)有檢測(cè)到DNA ladder。
　　其次，本文還利用斑馬魚(yú)胚胎，比較研究了以上3種增塑劑的胚胎毒性，對(duì)這3種增塑劑對(duì)胚胎各個(gè)發(fā)育階段產(chǎn)生的畸形特征、24 h的致死率和72 h的孵化率的檢測(cè)結(jié)果表明，（1）這三種增塑劑均能影響胚胎的發(fā)育，4 h時(shí)可觀察到胚胎自溶的現(xiàn)象，8 h時(shí)可觀察到外包變緩的現(xiàn)象，12 h時(shí)可觀察到無(wú)體節(jié)形成的現(xiàn)象，24 h時(shí)可觀察到無(wú)頭部形成的現(xiàn)象，48 h時(shí)

10、可觀察到色素沉積減少或缺失的現(xiàn)象，72 h時(shí)可觀察到孵化率降低，并且出現(xiàn)心包囊腫的現(xiàn)象，96 h時(shí)可觀察到脊柱彎曲的現(xiàn)象。（2）24 h的致死率研究結(jié)果表明：隨著增塑劑濃度的升高，胚胎致死率也逐漸升高。在最低濃度時(shí)（0.005μg/mL），DEHP、DBP和TBAC的胚胎致死率分別為：16.7±5.8%、76.7±7.6%和18.3±2.9%。DBP的毒性較高，在50和150μg/mL時(shí)，胚胎全部死亡。而DEHP和TBAC在150μg/

11、mL的致死率分別為65±5%和75±5%。（3）72 h的孵化率也隨著增塑劑濃度的升高，孵化率逐漸降低。DBP在最低濃度（0.005μg/mL）時(shí)，胚胎的孵化率已經(jīng)比較低，為16.7±8.2%；在50和150μg/mL時(shí)，孵化率為0。而DEHP和TBAC在150μg/mL的孵化率分別為21.7±12.6%和10±13.2%。
　　最后，通過(guò)比較三種增塑劑之間的毒性差異，對(duì)不同增塑劑毒性作用的可能機(jī)制進(jìn)行了分析和討論。TBAC對(duì)牙鲆

12、鰓細(xì)胞FG和斑馬魚(yú)胚胎都具有毒性，并且毒性高于DEHP，這一結(jié)果與已報(bào)道的有關(guān)TBAC無(wú)毒的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致。
　　綜上所述，中性紅（NR）吸收法比MTT法更適合檢測(cè)這三種增塑劑對(duì)FG細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，其檢測(cè)結(jié)果與乳酸脫氫酶（LDH）釋放法檢測(cè)結(jié)果相一致；24 h的吖啶橙/溴化乙錠（AO/EB）雙熒光染色法檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明這三種增塑劑對(duì)FG細(xì)胞的致死可能不是通過(guò)凋亡誘導(dǎo)途徑；通過(guò)觀察這三種增塑劑對(duì)胚胎發(fā)育的影響，說(shuō)明其對(duì)斑馬魚(yú)胚胎都具