血腦屏障與腦內(nèi)β淀粉樣蛋白-,1-40-外流轉(zhuǎn)運的實驗研究.pdf

1、本研究首先通過RT-PCR和WesternBlot檢測腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株LRP-1的表達(dá)。然后通過人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)建立的BBB體外模型以及小鼠體內(nèi)實驗觀察腦內(nèi)Aβ1-40經(jīng)BBB外流轉(zhuǎn)運的特點，并通過抗LRP-1抗體、LRP-1受體拮抗劑——受體相關(guān)蛋白(receptorassociatedprotein，RAP)和Aβ1-40吸附劑凝溶膠蛋白干預(yù)，進(jìn)一步探討LRP-1與腦內(nèi)Aβ1-40經(jīng)BBB外流轉(zhuǎn)運的關(guān)系，以及外

2、周使用凝溶膠蛋白對腦內(nèi)Aβ1-40外流轉(zhuǎn)運的影響，初步探討“外周沉積”治療策略的可行性。 第一部分血腦屏障體外模型的建立與評價 目的l建立一種相對簡便而可靠的血腦屏障(blood-brainbarrier，BBB)體外模型。方法：將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbilicalveinendothelialcell，HUVEC)與小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte，As)進(jìn)行共培養(yǎng)建立BBB體外模型。電鏡技術(shù)觀察該模型

3、的形態(tài)特征，跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻抗測定觀察模型的物理屏障功能，14C一蔗糖與1251．牛血清白蛋白經(jīng)該模型的通透性測定觀察模型的屏障功能。結(jié)果：共培養(yǎng)后HUVEC間出現(xiàn)了緊密連接，第7天跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻達(dá)(267±24)Q／em2。BBB特征酶Y一谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶含量為(12．41±1．71)U／rog蛋白，與第2代HUVEC(2．76±1．00U／mg蛋白)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．01)。共培養(yǎng)和單層培養(yǎng)HUVEC對14C_蔗糖的通透系數(shù)分別

4、為(0．93+0．32)×10-3、(8．28'4-3．37)×10'3~rrdmin，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．01)。模型對125I_牛血清白蛋白具有良好的限制通透作用。 第二部分腦內(nèi)β淀粉樣蛋白1-40經(jīng)血腦屏障體外模型的外流轉(zhuǎn)運 目的：檢測腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株上LRP-1的表達(dá)，并觀察LRP-1與腦側(cè)B淀粉樣蛋白1-40經(jīng)BBB體外模型外流轉(zhuǎn)運的關(guān)系。方法：RT-PCR和WesternBlot法檢測共培養(yǎng)7d的HU

5、VEC、單獨培養(yǎng)的第2代HUVEC、小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株bend．3和人第3代AsLRP-1mRNA及蛋白水平的表達(dá)。分別在0min、lOmin、20min、30min、60min和120min6個時間點觀察外源性AB1-40(50nmol／L)經(jīng)BBB體外模型(HUVEC／As共培養(yǎng))的轉(zhuǎn)運，以及As側(cè)加RAP(200nmol／L)或抗LRP-1抗體(60ug／m1)預(yù)孵和HUVEC側(cè)加入凝溶膠蛋白(9ug/m1)對AB¨o經(jīng)BBB

6、體外模型轉(zhuǎn)運的影響。ELISA法檢測各組轉(zhuǎn)運實驗后培養(yǎng)液中AB1-40的濃度。結(jié)果：共培養(yǎng)、單獨培養(yǎng)的第2代HUVEC和bend．3均有LRP-1mRNA的表達(dá)。單獨培養(yǎng)的As無LRP-1mRNA的表達(dá)。共培養(yǎng)與單獨培養(yǎng)的第2代HUVEC均存在LRP-1蛋白水平的表達(dá)。共培養(yǎng)和單獨培養(yǎng)的As均無LRP-1蛋白水平的表達(dá)。Westernblot的結(jié)果與RT-PCR結(jié)果一致。隨轉(zhuǎn)運時間延長，As側(cè)AB1-40濃度逐步降低，20min時由(2

7、00．12-+-15．01)pg／m]降低到(99．07±¨．92)pg／n~。2h后濃度為(44．92_7．40)pg／ml。RAP預(yù)處理后，各時間點As側(cè)AB1-4n濃度與對照組的差異有顯著性(P<0．05)。LRP-1預(yù)處理后，各時間點As側(cè)AB1-．40濃度與對照組的差異有顯著性(P<0．05)，與RAP組的差異無顯著性(P>0．05)。凝溶膠蛋白組各時間點As側(cè)AB1-40濃度與對照組的差異有顯著性(P<0．05)。AB1-4

8、0經(jīng)BBB的外流轉(zhuǎn)運不影響B(tài)BB的屏障功能。 第三部分LRP-1與小鼠腦內(nèi)B淀粉樣蛋白1-40外流轉(zhuǎn)運的體內(nèi)實驗 目的：通過體內(nèi)實驗觀察LRP-1與小鼠腦內(nèi)AB1-40外流轉(zhuǎn)運的關(guān)系。 結(jié)論 1．HUVEC與小鼠As共培養(yǎng)建立的BBB體外模型能較好模擬在體BBB類似的結(jié)構(gòu)與屏障功能。HUVEC的原代培養(yǎng)相對簡單，容易達(dá)到共培養(yǎng)對細(xì)胞純度的要求。培養(yǎng)液中加入氫化可的松后，HUVEC增殖迅速，節(jié)省構(gòu)建模型所需

9、要的時間，同時加入激素也有助于BBB體外模型的生物學(xué)特性的維持。 2．通過RT-PCR和WesternBlot方法檢測到腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株上LRP-1的表達(dá)。50nmol／L外源性AB1-40經(jīng)BBB體外模型外流轉(zhuǎn)運的半衰期在20min左右。而此濃度與3～4月齡B淀粉樣前體蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)AB1-40濃度相當(dāng)，由此提示，生理狀態(tài)下BBB具有強(qiáng)大的清除腦內(nèi)AB1-40的能力。抗LRP-1抗體能夠抑制AB1-40的外流轉(zhuǎn)運，RAP

10、同樣能抑制腦側(cè)高濃度AB1．40的外流轉(zhuǎn)運，其抑制能力與抗LRP-1抗體相當(dāng)。外周使用凝溶膠蛋白促進(jìn)腦側(cè)外源性AB1-40的外流轉(zhuǎn)運。 3．小鼠腦內(nèi)注射抗LRP-1抗體后，腦內(nèi)AB1-40負(fù)荷增加，同時出現(xiàn)血漿AB1-40濃度的降低，提示腦內(nèi)注射抗LRP一1抗體能夠抑制腦內(nèi)AB1-40的外流轉(zhuǎn)運。腦內(nèi)注射RAP后，腦內(nèi)AB1-40負(fù)荷增加，同時出現(xiàn)血漿AB1-40濃度的降低，提示腦內(nèi)注射RAP能夠抑制腦內(nèi)AB1-40的外流轉(zhuǎn)運，