中國(guó)野生葡萄醛脫氫酶基因轉(zhuǎn)化歐洲無(wú)核葡萄的研究.pdf

1、本研究以“紅寶石無(wú)核”、“長(zhǎng)穗無(wú)核白”和“紅臉無(wú)核”為材料，從器官發(fā)生途徑和胚狀體發(fā)生途徑建立無(wú)核葡萄遺傳轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)，將連接在表達(dá)載體pWR306的中國(guó)野生葡萄醛脫氫酶相關(guān)基因(ALDH)導(dǎo)入農(nóng)桿菌中，進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葡萄遺傳轉(zhuǎn)化體系及轉(zhuǎn)基因葡萄檢測(cè)的研究，取得的主要結(jié)果如下： 1.以“紅寶石無(wú)核”和“長(zhǎng)穗無(wú)核白”葡萄的試管苗葉片、葉柄及莖段為材料，研究不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)兩個(gè)葡萄品種葉片、葉柄和莖段不定芽再生的影響。結(jié)果表

2、明，誘導(dǎo)“紅寶石無(wú)核”葉片不定芽再生的最佳培養(yǎng)基為MS+TDZ2.0mg/L+NAA0.1mg/L，再生率為33.33％；“長(zhǎng)穗無(wú)核白”葉片、葉柄不定芽再生的最佳培養(yǎng)基均為MS+BAP5.0mg/L+NAA0.5mg/L，再生率分別為25％和30.01％；“紅寶石無(wú)核”的葉柄不定芽再生率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其葉片?！凹t寶石無(wú)核”和“長(zhǎng)穗無(wú)核白”莖段不定芽再生率都較低，最高分別為5.22％和2.78％。不定芽伸長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)基為1/2MS+BAP1.0

3、mg/L+IBA0.5mg/L。再生植株的生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA0.2mg/L。 2.以“紅臉無(wú)核”花藥、子房為材料，研究胚狀體發(fā)生途徑的再生。結(jié)果表明：花藥胚性愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+BAP0.5mg/L+2,4-D0.5mg/L，誘導(dǎo)率為60％；子房胚性愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+BAP1.0mg/L+2,4-D1.0mg/L，誘導(dǎo)率為25％。胚性愈傷組織接種在不含2,4-D的原培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出胚狀體，花藥

4、胚狀體的誘導(dǎo)率為84.67％，子房胚狀體的誘導(dǎo)率為41.67％。無(wú)激素的MS培養(yǎng)基是胚狀體增殖和萌發(fā)的培養(yǎng)基；最佳的成苗培養(yǎng)基為WPM+IBA0.1mg/L+蔗糖15g/L，成苗率為64.0％。 3.含醛脫氫酶相關(guān)基因(ALDH)的農(nóng)桿菌GV3101作為轉(zhuǎn)化侵染菌液。通過(guò)器官發(fā)生途徑和胚狀體發(fā)生途徑，獲得抗性再生葡萄植株。進(jìn)行ALDH基因的PCR檢測(cè)，結(jié)果表明：侵染“紅寶石無(wú)核”葉片獲得了17個(gè)株系的抗性再生植株，獲得1個(gè)株系的

5、PCR陽(yáng)性植株，PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)化率為5.88％；轉(zhuǎn)化“長(zhǎng)穗無(wú)核白”的葉柄獲得了18個(gè)株系的抗性再生植株，PCR檢測(cè)出3個(gè)陽(yáng)性植株，陽(yáng)性率為16.67％。侵染“長(zhǎng)穗無(wú)核白”的葉柄愈傷獲得66個(gè)株系的抗性再生植株，PCR檢測(cè)出16個(gè)株系的陽(yáng)性植株，轉(zhuǎn)化率為24.24％；侵染“紅臉無(wú)核”胚性愈傷組織，獲得9個(gè)株系的抗性再生植株；侵染“紅臉無(wú)核”胚狀體，獲得了102個(gè)株系的抗性再生植株，隨機(jī)選取了30個(gè)株系進(jìn)行PCR檢測(cè)，有16個(gè)株系是陽(yáng)性植株，

6、陽(yáng)性率為53.33％。實(shí)驗(yàn)中胚狀體發(fā)生途徑獲得的“紅臉無(wú)核”葡萄的抗性再生率最高，PCR檢測(cè)陽(yáng)性率也較高。 4.“長(zhǎng)穗無(wú)核白”關(guān)于ALDH基因的PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性的6個(gè)轉(zhuǎn)化株系，進(jìn)行HPTⅡ基因的PCR檢測(cè)全是陽(yáng)性植株?！伴L(zhǎng)穗無(wú)核白”關(guān)于ALDH基因的PCR檢測(cè)呈陰性的16個(gè)株系，進(jìn)行HPTⅡ基因的PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有2株是陽(yáng)性植株。 5.“長(zhǎng)穗無(wú)核白”的5個(gè)PCR陽(yáng)性株系進(jìn)行HPTⅡ基因的PCR-Southern檢測(cè)，結(jié)果