殺松材線蟲海洋放線菌HT-8的分離鑒定、培養(yǎng)條件及其活性物質(zhì)分析.pdf

1、松樹萎蔫病是松屬植物的一種毀滅性疾病，松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）是松樹萎蔫病的重要病原物，該疾病在全球范圍內(nèi)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失和環(huán)境破壞。從自然界中尋找對(duì)松材線蟲具有高致死性的微生物及其代謝產(chǎn)物已成為研發(fā)新型殺線蟲劑的一個(gè)研究熱點(diǎn)。
　　本文對(duì)從青島麥島近海海域采集的樣品采用稀釋涂布平板法分離共得到21株海洋放線菌，使用浸漬法對(duì)放線菌培養(yǎng)濾液進(jìn)行殺松材線蟲活性測(cè)定，從中篩選出了1株具有較高殺

2、線活性的放線菌HT-8。該菌株分離自海泥，其培養(yǎng)濾液處理松材線蟲72 h，松材線蟲的校正死亡率高達(dá)88.30％。通過形態(tài)學(xué)觀察，生理生化特性和16S rDNA序列測(cè)定及其系統(tǒng)發(fā)育分析，將菌株HT-8鑒定為白蟻鏈霉菌（Streptomyces termitum）。采用單因素法分析菌株HT-8的最佳培養(yǎng)條件，結(jié)果表明，產(chǎn)殺線活性物質(zhì)的最適培養(yǎng)基海水濃度、起始pH、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間分別為1000 mL/L、pH7.5、25℃、7 d；最適接

3、種體菌齡和接種量分別為48 h和6%。對(duì)培養(yǎng)基海水濃度、起始pH、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果表明，菌株HT-8的培養(yǎng)濾液殺線蟲活性達(dá)到最大的組合為海水濃度1000 mL/L，培養(yǎng)溫度25℃，pH7.5，培養(yǎng)時(shí)間5 d。對(duì)菌株HT-8殺線活性物質(zhì)的穩(wěn)定性進(jìn)行了測(cè)定，確定其活性物質(zhì)具有熱穩(wěn)定性以及在弱堿性條件下殺線活性穩(wěn)定的特點(diǎn)。對(duì)菌株發(fā)酵液進(jìn)行殺線活性組分分析，結(jié)果表明菌株發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取相具有很強(qiáng)的殺線活性，72 h的殺線

4、活性可以達(dá)到98.2%。對(duì)乙酸乙酯相進(jìn)行硅膠柱層析、凝膠色譜柱層析和制備高效液相色譜進(jìn)行分離和純化，獲得兩種化合物，通過質(zhì)譜及核磁共振波譜將該化合物確定為Hexahydropyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione和4-Methyl-5-ethylthiazole，這兩種化合物在濃度為1 mg/mL時(shí)，處理松材線蟲72 h線蟲校正死亡率分別為77.30%和72.62%。該研究可為海洋微生物資源的開發(fā)及其殺松材線蟲天