日本血吸蟲29KD膜外蛋白抗體檢測(cè)的價(jià)值及其單克隆抗體的制備與鑒定.pdf

1、目的：為尋找新的血吸蟲病免疫診斷候選抗原分子，對(duì)日本血吸蟲29KD表膜蛋白(sj29)的膜外區(qū)進(jìn)行體外重組表達(dá)、純化及免疫定位，通過初步的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)驗(yàn)證日本血吸蟲重組表膜蛋白rsj29用于日本血吸蟲病抗體檢測(cè)的特異性、敏感性及療效考核所具有的實(shí)用價(jià)值。同時(shí)用純化的重組蛋白rsj29免疫小鼠，制備及鑒定單克隆抗體，初步建立抗體夾心ELISA法，擬進(jìn)一步探討該單克隆抗體用于血吸蟲病人血清循環(huán)抗原檢測(cè)的應(yīng)用價(jià)值。 方法：以日本血吸蟲童蟲

2、cDNA文庫(kù)為模板，擴(kuò)增目的基因，構(gòu)建sj29的膜外區(qū)的原核表達(dá)系統(tǒng)，在大腸桿菌中獲得了融合表達(dá)，用親和層析法制備純化的rsj29膜外蛋白；用急性、慢性和晚期日本血吸蟲患者血清和正常人血清進(jìn)行Western blotting鑒定。用血吸蟲成蟲冰凍切片以抗rsj29蛋白小鼠免疫血清作為一抗行間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察sj29在日本血吸蟲成蟲的免疫定位。在確定重組蛋白抗原包被濃度、血清稀釋度以及酶標(biāo)抗體工作濃度的基礎(chǔ)上，用rsj29-ELISA和

3、成蟲粗抗原(AWA)-ELISA兩種方法平行檢測(cè)35例急性、38例慢性和27例晚期日本血吸蟲病人血清、27例華支睪吸蟲感染者、29例鉤蟲感染者和30例正常對(duì)照者血清中抗體，比較不同方法之間的敏感性，特異性以及交叉反應(yīng)性。另外，還用rsj29蛋白免疫小鼠6周后，將其脾細(xì)胞與SP2/0胃髓瘤細(xì)胞進(jìn)行雜交融合，HAT篩選出雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)亞克隆及擴(kuò)大培養(yǎng)，建立能穩(wěn)定分泌抗日本血吸蟲膜蛋白sj29單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。用間接ELISA法檢測(cè)雜

4、交瘤上清和小鼠腹水效價(jià)。采用Sigma抗體亞型檢測(cè)試劑盒測(cè)定單克隆抗體的Ig類別和亞型。 Westem-Blotting實(shí)驗(yàn)鑒定其免疫學(xué)特性。用血吸蟲成蟲冰凍切片以抗rsj29蛋白單克隆抗體的小鼠腹水作為一抗行間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察2株單克隆抗體在日本血吸蟲成蟲的識(shí)別位點(diǎn)。用棋盤滴定法同時(shí)選擇包被用抗rsj29兔多克隆抗體、抗rsj29小鼠單克隆抗體以及HRP-山羊抗小鼠抗體的工作濃度。結(jié)果成功克隆并用原核系統(tǒng)表達(dá)rsj29蛋白，

5、純化的rsj29膜外蛋白用Western blotting證實(shí)能夠被急性、慢性和晚期日本血吸蟲感染患者血清識(shí)別而與正常人血清無反應(yīng)。免疫熒光定位結(jié)果證實(shí)了生物信息學(xué)的推測(cè)--sj29蛋白是日本血吸蟲成蟲表膜蛋白，該蛋白在日本血吸蟲成蟲的體被表達(dá)非常豐富。rsj29-ELISA和AWA-ELISA兩種方法平行檢測(cè)急、慢性和晚期血吸蟲病患者，華支睪吸蟲患者，腸道線蟲患者以及正常人血清抗體， 結(jié)果：rSi29-ELISA法檢測(cè)急性、慢

6、性和晚期日本血吸蟲病患者血清抗體的敏感性分別為91.4％、89.5％和96.3％，與AWA-ELISA(91.4％、89.5％和88.9％)相比，兩者敏感性統(tǒng)計(jì)學(xué)分析上無顯著性差異；檢測(cè)鉤蟲、華支睪吸蟲感染者血清抗體的結(jié)果顯示rSj29-ELISA(17.2％、8.1％)與AWA-ELISA(27.6％、18.5％)相比前者的交叉反應(yīng)率絕對(duì)值較后者低，但統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著性差異，需加大樣本量進(jìn)一步確認(rèn)；檢測(cè)日本血吸蟲感染治療半年后患者血清抗

7、體的陰轉(zhuǎn)率兩者相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義，前者(55.9％)的陰轉(zhuǎn)率明顯比后者(8.9％)的高，說明rSi29-ELISA可考慮作為療效考核的重要參考指標(biāo)之一。與此同時(shí)獲得兩株特異性分泌抗sj29單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，經(jīng)過體外多次傳代培養(yǎng)后，仍能分泌高效價(jià)的抗體，細(xì)胞上清效價(jià)穩(wěn)定在1:800~1:3200之間。用BALB/c小鼠制備單抗腹水，ELISA法測(cè)效價(jià)在1.024×105以上。兩株雜交瘤細(xì)胞的抗體亞型均為IgG1。Western

8、-Blotting證實(shí)兩株細(xì)胞均為分泌抗sj29單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示兩株雜交瘤細(xì)胞抗體的識(shí)別位點(diǎn)在日本血吸蟲成蟲的體被表膜上。初步建立了雙抗體夾,bELISA用于血吸蟲病人血清循環(huán)抗原檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)方法。 結(jié)論：本研究獲得了預(yù)期的rsj29膜外區(qū)融合蛋白，證實(shí)了該重組蛋白具有較好的免疫反應(yīng)性和免疫原性，間接免疫熒光結(jié)果顯示sj29是日本血吸蟲成蟲表膜蛋白。以rsj29膜外區(qū)融合蛋白包被建立了rSj29-ELI

9、SA方法用于血吸蟲病人血清循環(huán)抗體的檢測(cè)，獲得較好的敏感性和特異性，尤其在療效考核方面比AWA-ELISA更具優(yōu)越性。 該重組抗原制備簡(jiǎn)便，成本低廉，制備周期短，方法易于標(biāo)準(zhǔn)化，更適合商品化生產(chǎn)和流行區(qū)血吸蟲病的血清學(xué)輔助診斷。同時(shí)獲得了2株特異性分泌抗Si29單克隆抗體的細(xì)胞株，且細(xì)胞上清和腹水中單克隆抗體的效價(jià)均較高。兩株單抗亞型均為IgG1。westem-Blotting結(jié)果證實(shí)了該2株單克隆抗體的免疫學(xué)特性，免疫熒光實(shí)驗(yàn)