非配體依賴型MET磷酸化介導(dǎo)Src活化參結(jié)腸癌細(xì)胞對西妥昔單抗耐藥的機(jī)制研究.pdf

1、目的
　　對于晚期結(jié)直腸癌病人來說，全身化療是最常用最有效的治療手段之一，但兩種常用的化療方案——FOLFOX和FOLFIRI的療效有限，生存期只有15個(gè)月左右。EGFR通路活化在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，參與腫瘤細(xì)胞的存活、增殖、血管生成、侵襲及轉(zhuǎn)移等。西妥昔單抗（Cetuximab，簡稱C225，商品名愛必妥@）是第一個(gè)抗EGFR單克隆抗體，可以在胞外區(qū)競爭性結(jié)合EGFR，抑制其與天然配體的結(jié)合，從而阻斷了下游信號通路。臨

2、床研究證實(shí)西妥昔單抗聯(lián)合化療可有效提高晚期結(jié)直腸癌病人的療效，延長生存。2004年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)西妥昔單抗用于結(jié)直腸癌的治療。
　　隨著西妥昔單抗在臨床應(yīng)用增多和基礎(chǔ)研究的深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)只有KRAS野生型結(jié)直腸癌病人應(yīng)用西妥昔單抗聯(lián)合化療才能提高療效，KRAS突變的病人應(yīng)用則基本無效或收效甚微。因此，ASCO指南自2009年開始推薦西妥昔單抗只適用于KRAS野生型結(jié)直腸癌病人，KRAS突變成為指南推薦的唯一療效預(yù)測標(biāo)志物。通過K

3、RAS基因檢測可以篩選出60％左右的晚期結(jié)直腸癌病人是KRAS野生型，但是實(shí)際上，在所有KRAS野生型病人中只有60％左右應(yīng)用西妥昔單抗有效，說明有40％的KRAS野生型結(jié)直腸癌病人存在著原發(fā)性耐藥，而在60％對西妥昔單抗有效的病人在應(yīng)用過程中也部分發(fā)生了繼發(fā)性耐藥，這些耐藥限制了西妥昔單抗的臨床應(yīng)用。
　　KRAS野生型對西妥昔單抗耐藥的機(jī)制有很多:EGFR配體和受體過表達(dá)，EGFR泛素化，EGFR核轉(zhuǎn)位，EGFR變異體Ⅲ(EG

4、FRvⅢ)，EGFR同其它跨膜蛋白形成異源二聚體，非受體酪氨酸激酶c-Src間接活化EGFR通路，繞開EGFR通路的其它受體酪氨酸激酶受體的活化（如IGF-1R和HGF/MET通路）等。在眾多耐藥機(jī)制中，HGF/MET通路的替代活化和下游Src家族激酶(SFK)活化是EGFR抑制劑產(chǎn)生耐藥的重要原因。
　　HGF/MET通路促進(jìn)腫瘤增殖、存活、侵襲、轉(zhuǎn)移。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，MET通路的活化與靶向藥物（包括HER2抑制劑和EGFR抑

5、制劑）耐藥有關(guān)。有關(guān)HGF/MET通路在耐藥中的作用成為研究熱點(diǎn)，已經(jīng)開展了多個(gè)針對HGF/MET通路拮抗劑和抑制劑的臨床研究，具有一定的應(yīng)用前景。Src家族激酶在受體介導(dǎo)的信號傳遞及細(xì)胞間通訊中具有中心調(diào)節(jié)作用，Src活化是HER2抑制劑和EGFR抑制劑耐藥的共同機(jī)制。因此，本研究結(jié)合了HGF/MET通路和下游的Src因子，深入探討了非配體依賴的MET活化在結(jié)腸癌細(xì)胞中參與西妥昔單抗耐藥的機(jī)制及下游因子Src調(diào)節(jié)MET活化參與耐藥的機(jī)

6、制。
　　材料與方法
　　1、采用MTT法測定細(xì)胞活力，繪制細(xì)胞增殖曲線。
　　2、集落形成實(shí)驗(yàn)觀察藥物作用后細(xì)胞克隆的形成。
　　3、Westernblot檢測信號通路相關(guān)蛋白變化:MET、EGFR、Src、Akt、ERK、PARP、Caspase-3等。
　　4、免疫共沉降檢測蛋白之間的相互結(jié)合。
　　5、采用LipofectamineTAM2000試劑進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染下調(diào)MET蛋白表達(dá)。
　　

7、6、免疫熒光檢測細(xì)胞膜表面p-MET表達(dá)。
　　7、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，兩組間差異采用Student'st檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1、西妥昔單抗誘導(dǎo)了相對耐藥的結(jié)腸癌細(xì)胞系Caco-2發(fā)生MET磷酸化
　　通過檢測8種結(jié)腸癌細(xì)胞(SW480、HCT-116、DLD-1、HT-29、RKO、Caco-2、DiFi和LIM1215)基礎(chǔ)蛋白表

8、達(dá)及對西妥昔單抗的敏感性，發(fā)現(xiàn)EGFR、MET和Src及其磷酸化水平的基礎(chǔ)表達(dá)與對西妥昔單抗的敏感性沒有明顯相關(guān)性。進(jìn)一步研究西妥昔單抗作用于KRAS、BRAF和PIK3CA均為野生型的Caco-2和DiFi細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，西妥昔單抗誘導(dǎo)了KRAS野生型細(xì)胞中對西妥昔單抗相對耐藥的Caco-2細(xì)胞（西妥昔單抗10μg/ml作用72h時(shí)抑制率為15.76±2.42％）發(fā)生p-MET明顯活化，而西妥昔單抗作用于相對敏感的DiFi細(xì)胞（西妥昔單抗

9、10μg/ml作用72h時(shí)抑制率為40.68±5.46％）后可抑制p-MET表達(dá)。通過免疫熒光檢測膜表面的p-MET表達(dá)，也證實(shí)了西妥昔單抗作用于Caco-2細(xì)胞48h后p-MET膜表達(dá)增強(qiáng)。根據(jù)這兩種對西妥昔單抗敏感性不同的KRAS野生型結(jié)腸癌細(xì)胞應(yīng)用西妥昔單抗后p-MET表達(dá)的差異，推測在沒有配體刺激情況下發(fā)生的非配體依賴MET磷酸化參與了結(jié)腸癌細(xì)胞對西妥昔單抗的耐藥。
　　2、MET抑制劑PHA-665752可抑制西妥昔單抗

10、誘導(dǎo)的p-MET活化，與西妥昔單抗聯(lián)用促進(jìn)凋亡
　　應(yīng)用MET抑制劑PHA-665752不僅抑制了Caco-2細(xì)胞自身的MET磷酸化，也明顯抑制了西妥昔單抗誘導(dǎo)的p-MET活化，同西妥昔單抗聯(lián)合應(yīng)用促進(jìn)了PARP和Caspase-3裂解。MTT結(jié)果顯示，西妥昔單抗作用48h的存活率是83.49±1.46％，PHA-665752單藥存活率是70.00±6.87％，兩藥聯(lián)合的存活率是63.12±7.22％，兩藥聯(lián)合較單用西妥昔單抗或單

11、藥PHA-665752提高了抑制率（P值分別為0.013和0.003）。集落形成實(shí)驗(yàn)也證實(shí)兩藥聯(lián)合的細(xì)胞克隆數(shù)目減少。
　　3、通過siRNA下調(diào)MET蛋白表達(dá)后應(yīng)用西妥昔單抗可進(jìn)一步抑制下游PI3K/Akt和MAPK/ERK通路，促進(jìn)凋亡
　　采用LipofectamineTAM2000試劑進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染下調(diào)Caco-2細(xì)胞中MET蛋白表達(dá)，兩對siRNA序列可下調(diào)MET蛋白表達(dá)約70％，同時(shí)可促進(jìn)PARP裂解，下調(diào)p-Ak

12、t和p-ERK表達(dá)。在轉(zhuǎn)染對照siRNA組（ScrambledsiRNA）和METsiRNA組分別加入西妥昔單抗作用48h后發(fā)現(xiàn)，METsiRNA組加入西妥昔單抗較對照組可進(jìn)一步促進(jìn)PARP裂解、下調(diào)p-Akt和p-ERK表達(dá)，說明MET通路在Caco-2細(xì)胞對西妥昔單抗的耐藥機(jī)制中起到重要作用。
　　4、西妥昔單抗作用Caco-2細(xì)胞48h后發(fā)生p-Src活化，而作用DiFi細(xì)胞后p-Src表達(dá)被抑制
　　在西妥昔單抗作用

13、于Caco-2細(xì)胞中，下游因子Src不斷被活化，下游的p-Akt和p-ERK受到輕度抑制，而西妥昔單抗作用于DiFi細(xì)胞后p-Src被抑制，下游的p-Akt和p-ERK被明顯抑制，推測Src活化也參與了Caco-2細(xì)胞對西妥昔單抗的耐藥。
　　5、Src抑制劑PP2和達(dá)沙替尼(dasatinib)可降低西妥昔單抗誘導(dǎo)的p-MET活化，抑制下游PI3K/Akt和MAPK/ERK通路，促進(jìn)凋亡，增強(qiáng)對西妥昔單抗的敏感性
　　通過

14、應(yīng)用Src抑制劑PP2和dasatinib發(fā)現(xiàn)，Src抑制劑可明顯抑制西妥昔單抗誘導(dǎo)的p-MET活化，并抑制了下游PI3K/Akt和MAPK/ERK信號通路，增強(qiáng)了PARP和Caspase-3的裂解。西妥昔單抗與Src抑制劑聯(lián)合進(jìn)一步下調(diào)p-Akt，增強(qiáng)了凋亡作用，并提高了藥物的敏感性。Src抑制劑PP2和西妥昔單抗作用48h的MTT結(jié)果顯示，西妥昔單抗的存活率是84.47±4.25％，PP2單藥存活率是64.42±6.14％，兩藥聯(lián)合

15、的存活率是56.51±7.04％，兩藥聯(lián)合較單用西妥昔單抗或單藥PP2提高了抑制率（P值分別為0.024和0.002）。Src抑制劑dasatinib和西妥昔單抗作用48h的MTT結(jié)果顯示，西妥昔單抗的存活率是87.98±1.69％，dasatinib單藥存活率是77.13±0.48％，兩藥聯(lián)合的存活率是62.33±2.77％，兩藥聯(lián)合較單用西妥昔單抗或單藥dasatinib提高了抑制率（P值分別為0.001和0.005）。以上結(jié)果證實(shí)

16、，Src活化與MET活化在西妥昔單抗的耐藥中密切相關(guān)，抑制Src活化可進(jìn)一步增強(qiáng)對西妥昔單抗的敏感性。
　　6、西妥昔單抗誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞形成MET/Src/EGFR復(fù)合物
　　西妥昔單抗作用于Caco-2細(xì)胞后募集了EGFR，增強(qiáng)了MET與Src表達(dá)，形成了MET/Src/EGFR復(fù)合物，而西妥昔單抗作用于DiFi細(xì)胞沒有募集EGFR，并使MET與Src的天然結(jié)合減弱。推斷MET/Src/EGFR復(fù)合物的形成可能是活化

17、p-MET、產(chǎn)生對西妥昔單抗耐藥的原因之一。應(yīng)用MET抑制劑PHA-665752可抑制MET/Src/EGFR復(fù)合物的形成，Src抑制劑和MET抑制劑均可抑制復(fù)合物中MET和Src的磷酸化水平。
　　結(jié)論
　　1、非配體依賴的MET磷酸化是KRAS野生型結(jié)腸癌細(xì)胞對西妥昔單抗耐藥的機(jī)制之一。
　　2、MET抑制劑PHA-665752可抑制西妥昔單抗誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞發(fā)生的p-MET活化，與西妥昔單抗聯(lián)用促進(jìn)凋亡，增強(qiáng)

18、了對西妥昔單抗的敏感性。
　　3、下調(diào)MET蛋白表達(dá)后應(yīng)用西妥昔單抗可進(jìn)一步抑制下游PI3K/Akt和MAPK/ERK通路，并促進(jìn)了凋亡。
　　4、Src活化參與了Caco-2細(xì)胞對西妥昔單抗的耐藥，Src活化與MET活化在西妥昔單抗耐藥中密切相關(guān)。抑制Src活化可抑制西妥昔單抗誘導(dǎo)的p-MET活化和下游PI3K/Akt通路，促進(jìn)凋亡，增強(qiáng)了西妥昔單抗的敏感性。
　　5、西妥昔單抗作用于Caco-2細(xì)胞后募集了EGFR