以顆粒酶B為靶向的磁共振對比劑的制備.pdf

1、靶向磁共振成像技術是近年來產生的新型磁共振成像技術，它利用磁共振對比劑二乙三胺五乙酸釓(Gd-DTPA)與特異性載體分子如單克隆抗體結合形成靶向對比劑。在特異性載體分子的引導下，靶向對比劑可以在該載體分子靶向的器官，機體某部位或疾病組織特異性濃聚，改變組織中周圍水分子的T1弛豫時間，從而形成特異性磁共振圖像。同時，結合了載體分子的對比劑也可以增加對比劑在組織中的保留時間，延長增強效果。與傳統(tǒng)磁共振成像比較，靶向磁共振成像技術具備了較高的

2、敏感性，同時新合成的靶向對比劑也能夠克服非特異性對比劑的應用局限，對于疾病的早期特異性診斷有一定的價值。目前靶向磁共振技術的研究在腫瘤學領域比較活躍，但在其他方面的應用還有待深入。眾所周知，移植排斥反應具有明顯的免疫反應激活與炎癥細胞浸潤過程，其中也涉及了許多免疫相關分子的特異性表達。顆粒酶B(GB)是細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的主要效應分子，在急性排斥(AR)反應中，活化后的T淋巴細胞釋放顆粒酶B進入靶細胞，激活核酸內切酶系統(tǒng)，使靶

3、細胞DNA斷裂，引起靶細胞凋亡，目前許多研究都提示顆粒酶B對于移植腎排斥的早期診斷有一定的臨床價值。
　　 目的：利用抗顆粒酶B單抗與Gd-DTPA偶聯(lián)，探討其合成的最佳條件，有效性及安全性，以期合成一種新的磁共振對比劑，為移植腎急性排斥反應建立更具特異性的早期無創(chuàng)診斷方法。
　　 方法：⑴MRI對比劑Gd-DTPA-GB mAb制備：將DTPABA溶于二甲基酰胺，配成DTPABA溶液，將顆粒酶B抗體與DTPABA混勻，

4、室溫孵育。PD-10柱子純化，測定抗體濃度。GdCl3加入NaAc，取該液加入洗脫液中，室溫震蕩。PD-10柱子純化，收集洗脫液，分裝，4℃存放。⑵鑒定Gd-DTPA-GB mAb對比劑及連接效率：基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(matrix assisted laser desorption ionization/time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)(Voyager-DE ST

5、R4349)光譜測定是否連接并計算每分子抗體連接的Gd3+數(shù)量。⑶細胞毒性檢測：收集對數(shù)生長期人類腎小管上皮細胞，接種于96孔板。37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底，分別加入一定濃度梯度的Gd，Gd-DTPA，GdCl3和Gd-DIPA-GB mAb，孵育12小時，MTT法測定細胞毒性。⑷Gd-DTPA-GB mAb的免疫活性檢驗：取正常雄性成年SD大鼠甲狀腺組織，常規(guī)石蠟包埋切片，采用ABC法(Avidin-biotin-peroxida

6、se Complex method，卵白素-生物素-過氧化物酶連結法)，分為實驗組(Gd-DTPA-GB mAb)，陽性對照組(GBmAb)及陰性對照組(PBS)，通過免疫組化法比較三組之間的陽性結果表達量，從而判定Gd-DTPA-GB mAb的免疫活性。⑸統(tǒng)計學方法：細胞毒及免疫組化的實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)士標準差，組間比較采用t檢驗，SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，統(tǒng)計學檢驗水準為α=0.05，P<0.05時差異具有顯著性。
　　

7、 結果：①MALDI-TOF-MS鑒定結果顯示顆粒酶B單抗的質荷比高峰主要出現(xiàn)在133986.41處，而連接了Gd-DTPA后，高峰主要在139736.06的位置出現(xiàn)；根據(jù)質譜結果計算得每分子抗體可以連接20個左右的Gd3+；②MTT法結果顯示Gd，DTPA，Gd-DTPA以及Gd-DTPA-GB mAb組在濃度逐漸遞增的情況下對于細胞活性沒有明顯影響，且四組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)：③免疫組化結果顯示靶向對比劑Gd-DT

8、PA-GB mAb組陽性細胞數(shù)為13.4±3.12，陽性對照組陽性細胞數(shù)為14.53±0.81，陰性對照組陽性細胞數(shù)為0.00±0.00。組間比較采用t檢驗，其中陽性對照組，實驗組分別與陰性對照組比較均具有顯著性差異(P<0.0001)，且陽性對照組和實驗組比較沒有統(tǒng)計學差異(P=0.516)。
　　 結論：⑴Gd-DTPA能夠通過簡單的螯合反應和顆粒酶B單抗以相對較高的濃度結合，為靶向對比劑的合成提供借鑒。⑵MALDI-TOF