赭曲霉發(fā)酵產(chǎn)大黃素及其生物合成途徑和誘發(fā)機(jī)制的研究.pdf

1、大黃素(Emodin),1,3,8-三羥基-6-甲基蒽醌,具有抗病毒、抗炎、抗腫瘤、抑菌、擴(kuò)張血管、免疫抑制等多種生理功能,已經(jīng)成為一種十分有前途的新型藥物單體。目前大黃素的主要生產(chǎn)方式是從藥用植物大黃、虎杖中提取,產(chǎn)量低,質(zhì)量難以控制。而本實(shí)驗(yàn)室保藏的一株赭曲霉(Aspergillus ochraceusLP_0201)在自然狀態(tài)下便可以產(chǎn)生大黃素,為通過工業(yè)發(fā)酵的方式來高效地生產(chǎn)大黃素提供了可能。
　　 利用制備型HPLC純

2、化了大黃素單體。制備HPLC的條件為:流動相,甲醇:水(60:40,v/v);進(jìn)樣量,300mg;柱溫,室溫;流量,60mL/min;檢測波長,254nm。通過ESI-MS、ESI-MS/MS、UV-VIS、FT-IR、1H-NMR、13C-NMR和DEPT確證了大黃素的結(jié)構(gòu)。
　　 通過N+離子注入獲得大黃素高產(chǎn)菌株Aspergillus ochraoeus LP_0301,并優(yōu)化了發(fā)酵條件,使其最終產(chǎn)率達(dá)1.453mg/L,

3、比出發(fā)菌株提高2.96倍。優(yōu)化后的培養(yǎng)基為:鎂離子1.5 g/L,硝酸銨10g/L,蛋白胨10g/L,玉米淀粉75g/L;發(fā)酵條件為:溫度30℃,轉(zhuǎn)數(shù)140 r/min,初始pH為7,裝液量80 mL(250 mL),接種量10％,菌齡20h。
　　 研究了大黃素提取和精制方法。提取方式為有機(jī)溶劑回流法,提取條件為:料液比,1:12;醇濃度,100％;提取時間,1.5h。精制采用D101大孔樹脂,上樣流速為1.5mL/min,溫

4、度為20℃,上樣液中大黃素含量為1.0mg/mL。以中性90％乙醇在50℃下,2.0mL/min的速率沈脫。
　　 短鏈脂肪酸、氨基酸添加和代謝抑制實(shí)驗(yàn)表明,大黃素由聚酮途徑合成。通過RAPD分析,獲得兩個差異性擴(kuò)增片斷,一個片斷與AY272043.1和AY583208.1同源,證實(shí)大黃素通過聚酮途徑合成,另一個片斷與XM_002374227.1和AY585205.1同源,表明大黃素合成與氧自由基有關(guān)。通過HPLC-ESI-MS