5—氨基乙酰丙酸介導(dǎo)光動力學(xué)治療人胃癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、胃癌為我國高發(fā)腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率居惡性腫瘤首位。胃癌早期診斷困難，多數(shù)病例在確診時已屬中晚期，手術(shù)治療的5年生存率僅為20％～30％。近年來雖然出現(xiàn)了各種手術(shù)方式的改良及化療、放療方案的改進(jìn)，但收效甚微。手術(shù)切除無法清除所有的腫瘤細(xì)胞，且存在術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的弊端。而放、化療的副反應(yīng)大，療效亦不甚理想。近年來，隨著光動力治療(photodynamictherapy,PDT)技術(shù)的發(fā)展，加上纖維內(nèi)窺鏡和激光技術(shù)的不斷改進(jìn)，PDT療法

2、為早、晚期胃癌的根治、姑息治療都提供了新模式。腫瘤光動力治療(PDT)是80年代初興起、并在近年發(fā)展起來的一種新的治療腫瘤的方法，即利用腫瘤組織對特定化學(xué)物質(zhì)的選擇性攝入，這些特定的化學(xué)物質(zhì)在一定波長的光作用下產(chǎn)生光動力效應(yīng)而達(dá)到破壞腫瘤組織的目的。光動力治療的這種選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞、局部治療的特性非常適合消化系統(tǒng)腫瘤的輔助治療。光動力學(xué)治療的核心問題是光敏劑問題。目前在臨床上廣泛應(yīng)用得光敏劑是血卟啉衍生物(HPD)。HPD雖然在腫瘤的

3、臨床診斷和治療中都取得了肯定的療效，但仍有很多不足之處：作用光譜不理想；對組織的穿透能力較差；給藥至光照的時間間隔長;用藥前需皮試；價格昂貴；特別是皮膚光敏副作用較大，可持續(xù)至治療后六周。 第一章5－氨基乙酰丙酸介導(dǎo)的人胃癌細(xì)胞光動力學(xué)治療 目的： 探索新一代光敏劑5-ALA介導(dǎo)的PDT對人胃癌細(xì)胞的體外殺傷作用，及最佳用藥劑量、最佳用藥時間等。 方法： 1.光敏劑原卟啉在細(xì)胞內(nèi)的定位：常規(guī)爬片法

4、培養(yǎng)MGC-803人胃癌細(xì)胞并給予2mmol/L的5-ALA孵育6小時，熒光倒置顯微鏡及共聚焦顯微鏡下觀察。 2.光敏劑原卟啉的測定；對數(shù)期生長的MGC-803細(xì)胞，給予固定濃度的5-ALA培養(yǎng)不同的時間及固定時間、不同的濃度5-ALA培養(yǎng)，達(dá)到孵育時間后，用熒光分光光度計測量各細(xì)胞懸液熒光強(qiáng)度。 3.腫瘤集落形成實(shí)驗(yàn)：雙層軟瓊脂培養(yǎng)法分別培養(yǎng)單純MGC-803細(xì)胞組、單純5-ALA組、單純激光組、光動力學(xué)治療組的細(xì)胞。

5、 4.5-ALA孵育時間對其介導(dǎo)PDT的影響：使用相同濃度的5-ALA培養(yǎng)不同時間的MGC-803胃癌細(xì)胞，給予相同劑量的激光輻照，MTT法測定細(xì)胞存活率。 5.5-ALA濃度對其介導(dǎo)PDT的影響：使用不同濃度的5-ALA培養(yǎng)相同時間的MGC-803人胃癌細(xì)胞，給予相同劑量的激光輻照，MTT法測定細(xì)胞存活率。 6.激光能量對5-ALA介導(dǎo)PDT對細(xì)胞殺傷力的影響：使用相同濃度的5-ALA培養(yǎng)相同同時間的MGC-8

6、03人胃癌細(xì)胞，給予不同劑量的激光輻照，MTT法測定細(xì)胞存活率。 7.5-ALA本身對MGC-803細(xì)胞的影響：使用不同濃度的5-ALA培養(yǎng)相同時間的MGC-803胃癌細(xì)胞，不予激光輻照，MTT法測定細(xì)胞存活率。 8.單用激光輻照對MGC-803細(xì)胞的影響：不給予5-ALA、培養(yǎng)相同時間的MGC-803胃癌細(xì)胞，給予不同劑量的激光輻照，MTT法測定細(xì)胞存活率。 結(jié)論： 1.5-ALA與MGC-803人胃癌

7、細(xì)胞共同培養(yǎng)，可以產(chǎn)生光敏劑原卟啉PpⅨ。 2.光敏劑原卟啉PpⅨ位于細(xì)胞的胞漿、胞膜，胞核未見PpⅨ產(chǎn)生。 3.5-ALA與MGC-803細(xì)胞共同培養(yǎng)所產(chǎn)生的光敏劑PpⅨ的量在孵育6小時可達(dá)最高峰，并隨著5-ALA的濃度的增加而增加，但在2.00mmol/L時出現(xiàn)飽和。 4.在小劑量下，單純給予5-ALA及單純給予激光都不能明顯改變MGC-803腫瘤細(xì)胞的無限增殖的生物學(xué)特性。而5-ALA介導(dǎo)的光動力學(xué)治療卻明

8、顯地阻止了MGC-803腫瘤細(xì)胞的無限增殖形成集落的能力。 5.5-ALA介導(dǎo)的PDT對MGC-803胃癌細(xì)胞具有殺傷作用，最佳孵育時間為6小時，最佳藥物濃度為2.00mmol/L。5-ALA本身對細(xì)胞無明顯毒性作用。 第二章5－氨基乙酰丙酸介導(dǎo)的光動力學(xué)治療對裸鼠人胃癌移植瘤作用的研究 目的： 探索5-ALA介導(dǎo)的光動力學(xué)治療對裸鼠人胃癌移植瘤的作用。 方法： 1.以MGC-803人胃癌

9、細(xì)胞制備裸鼠人胃癌移植瘤模型。 2.人胃癌移植瘤的荷瘤裸鼠腫瘤直徑達(dá)到0.6cm時，腹腔注射無血清1640培養(yǎng)液配制的5-ALA溶液100mg/kg，6小時后置整體熒光成像系統(tǒng)下觀察采集動物瘤體發(fā)出的熒光信號。 3.測量荷瘤對照組、單純激光組、單純5-ALA組、5-ALA介導(dǎo)的PDT治療組四組治療后第1、3、7、14、21的裸鼠腫瘤大小并計算腫瘤體積，末次測量后處死裸鼠，切除腫瘤稱重并行病理檢查。 結(jié)論：

10、 5-ALA介導(dǎo)的光動力學(xué)治療對于裸鼠人胃癌移植瘤具有明顯的治療效果，而單純給予5-ALA及單純給予激光輻射沒有明顯的抑制作用。 第三章5－氨基乙酰丙酸介導(dǎo)的光動力治療人胃癌機(jī)制的研究 目的： 探索5－氨基乙酰丙酸介導(dǎo)的光動力學(xué)治療胃癌的可能機(jī)制。 方法： 1.常規(guī)爬片法培養(yǎng)MGC-803人胃癌細(xì)胞，隨機(jī)分為單純MGC-803細(xì)胞組、單純5-ALA組、單純給予激光組、光動力學(xué)治療組。使用Hoech

11、st33258凋亡檢測、AO-EB染色法檢測細(xì)胞凋亡。 2.收集單純MGC-803細(xì)胞組、單純5-ALA組、單純給予激光組、光動力學(xué)治療組各組細(xì)胞行Annexin-V-PI流式細(xì)胞術(shù)分析。 3.收集上述四組細(xì)胞行透射電鏡觀察。 4.荷瘤對照組、單純激光組、單純5-ALA組、5-ALA介導(dǎo)的PDT治療組裸鼠腫瘤組織行MDA含量測定。 5.上述四組裸鼠腫瘤組織行透射電鏡觀察。 6.上述四組裸鼠腫瘤組織

12、使用TUNEL法檢測組織細(xì)胞凋亡。 7.在原卟啉溶液中加入不同濃度的NaN3，觀測NaN3濃度對光敏劑原卟啉光漂白的影響。 結(jié)果： 1、5-ALA介導(dǎo)的光動力學(xué)對人MGC-803胃癌細(xì)胞的作用 (1)Hoechst33258凋亡染色法、AO-EB染色法均發(fā)現(xiàn)只有光動力學(xué)治療組有細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，而單純MGC-803細(xì)胞組、單純5-ALA組、單純給予激光組細(xì)胞基本無凋亡細(xì)胞。 (2)細(xì)胞透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)

13、光動力學(xué)治療組在存在大量死亡細(xì)胞的同時有部分凋亡細(xì)胞，而其他組細(xì)胞表現(xiàn)基本正常。 (3)Annexin-V-PI染色法流式細(xì)胞術(shù)定量分析示：單純MGC-803細(xì)胞組、單純5-ALA組、單純給予激光組、光動力學(xué)治療組四組的壞死率分別為1.15％±0.020％、1.18％±0.015％、1.12％±0.021％、56.49％±0.593％(F=26009.8P=0.0000)；凋亡率分別為2.34％±0.038％、2.40％±0.0

14、42％、2.34％±0.036％、21.21％±1.095％(F=885.90P=0.0000)；凋亡+壞死率分別3.49％±0.021％、3.58％±0.026％、3.45％±0.038％、77.70％±0.763％(F=28262.79P=0.0000)?？梢姡核慕M凋亡率、壞死率、凋亡+壞死率都有顯著性差異。其中光動力學(xué)治療組的凋亡率、壞死率、凋亡+壞死率都比其他三組顯著高。并且在光動力學(xué)治療組壞死率顯著高于凋亡率。 2、人

15、胃癌移植瘤裸鼠腫瘤組織的檢測 (1)荷瘤裸鼠腫瘤組織MDA(丙二醛)測定：荷瘤對照組、單純激光組、單純5-ALA組、5-ALA介導(dǎo)的PDT治療組四組腫瘤組織的MDA含量有顯著性差異(F=17.59P=0.0000)；5-ALA介導(dǎo)的PDT治療組的MDA含量顯著高于其他三組。提示5-ALA介導(dǎo)的PDT是通過光敏劑產(chǎn)生的活性氧物質(zhì)殺傷腫瘤細(xì)胞，含有Ⅰ型活性氧物質(zhì)產(chǎn)生機(jī)制。 (2)腫瘤組織透射電鏡觀察：5-ALA介導(dǎo)的PDT治

16、療組存在大量死亡細(xì)胞及部分凋亡細(xì)胞，而其他組細(xì)胞表現(xiàn)基本正常。 (3)裸鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡的檢測(TUNEL法)測定：荷瘤對照組、單純激光組、單純5-ALA組、5-ALA介導(dǎo)的PDT治療組四組腫瘤組織的凋亡指數(shù)分別為1.14％±0.17％、1.07％±0.18％、1.18％±0.09％、18.91％±9.56％，有顯著性差異(x2=18.237P=0.000)；5-ALA介導(dǎo)的PDT治療組的凋亡指數(shù)顯著高于其他三組。 3

17、、NaN3濃度對原卟啉PpⅨ光漂白的影響： 在同樣的條件下，五組原卟啉溶液加入不同濃度的NaN3在不同時間點(diǎn)的OD值(原卟啉PpⅨ濃度)曲線提示五條曲線的下降速度顯著不同(F=112034.8P=0.000)，隨著NaN3濃度的增高，曲線下降的幅度減小。提示NaN3對PpⅨ的光漂白有明顯的抑制作用，說明在PpⅨ的光敏化反應(yīng)中，有單線態(tài)氧的產(chǎn)生，包含有Ⅱ型活性氧物質(zhì)產(chǎn)生機(jī)制。 結(jié)論： 5-ALA介導(dǎo)的光動力學(xué)治療能