重組人紅細(xì)胞生成素糖基化程度與生物學(xué)活性相關(guān)性.pdf

1、重組人紅細(xì)胞生成素(1lecombinant Human Erythropoietin，rHLIEPO)是一種高度糖基化的糖蛋白，其分子骨架為165個氨基酸組成的肽鏈，具3個N-連接的糖基化位點和1個O-連接的糖基化位點，其中糖基部分的重量約占40％。它在生物體內(nèi)的活性不僅與其氨基酸序列有關(guān)，而且和蛋白質(zhì)糖基化程度密切相關(guān)。影響rHuEPO生物學(xué)活性的主要部分是糖基上的唾液酸，唾液酸的含量不同使rHuEPO的活性不同，故HuEPO糖基化

2、程度的測定是質(zhì)量控制的關(guān)鍵。實際工業(yè)化生產(chǎn)過程中，存在工程細(xì)胞株和發(fā)酵生產(chǎn)工藝的差異，會導(dǎo)致rHuEPO蛋白的糖基化的不同，從而影響rHuEPO產(chǎn)品的質(zhì)量。目前rHuEPO的產(chǎn)品質(zhì)量控制主要根據(jù)體內(nèi)效價的檢測結(jié)果，然而目前的rHuEPO體內(nèi)檢驗方法有明顯的缺陷，周期較長，并且存在實驗動物的個體差異，實驗的重復(fù)性不太理想。 為此，利用檢測rHuEPO糖基化程度的幾種理化方法，對六批不同生產(chǎn)工藝的rHuEPO原液，分別采用Folin

3、-酚試劑法測定蛋白質(zhì)的含量、利用間苯二酚顯色法測定總唾液酸含量、利用等電聚焦電泳測定等電點、利用毛細(xì)管區(qū)帶電泳檢測連接的多種寡糖形式以及定，性和定量分析各異構(gòu)體的豐度、利用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)測免疫學(xué)活性、利用動物網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)實驗測定生物學(xué)活性。根據(jù)各檢測結(jié)果，利用SPSS10.0統(tǒng)計分析軟件分析其與生物學(xué)活性的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)唾液酸含量和生物學(xué)活性之間存在明顯的正相關(guān)，而免疫學(xué)活性與生物學(xué)活性之間有明顯的偏離，兩者不存在相

4、關(guān)性；等電點與生物活性存在一定相關(guān)性，利用毛細(xì)管區(qū)帶電泳檢出rHuEPO蛋白均有糖基化不同的八個異構(gòu)體，研究發(fā)現(xiàn)各異構(gòu)體的豐度不僅僅與生物學(xué)活性和唾液酸之比存在顯著的相關(guān)性，而且與免疫學(xué)活性和唾液酸之比存在顯著的相關(guān)性，在此基礎(chǔ)上又研究了兩者之間的回歸關(guān)系，建立主要影響因子與免疫學(xué)活性、生物學(xué)活性和唾液酸之比線性回歸函數(shù)模型。，從而直觀、準(zhǔn)確的判斷rHuEPO的產(chǎn)品質(zhì)量，為全面快速評價產(chǎn)品質(zhì)量提供依據(jù)，為生產(chǎn)工藝的改進(jìn)和提高提供指導(dǎo)依據(jù)